一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法及应用，具体技术方法为：首先采用脐带华通氏胶间充质干细胞作为滋养层细胞诱导脐血单个核细胞中Treg细胞的初步增殖；然后通过磁珠分选得到较纯的Treg细胞；最后使用优化扩增因子刺激Treg细胞快速扩增。本发明专利技术采用人AB血浆、IL

【技术实现步骤摘要】
一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法及应用。

技术介绍

[0002]调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)是CD4
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T细胞中的一类重要细胞亚群，Treg细胞在诱导机体免疫耐受、维持免疫环境稳态、防止自身免疫性疾病发生等方面有着不可忽视的作用。Shimon Sakaguchi团队于1995年首次确定CD25(IL-2 receptorα-chain，IL-2RA)为Treg细胞的表面标志物，研究人员发现将去除CD4
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CD25
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亚群的淋巴细胞移植至裸鼠体内会引发多种自身免疫性疾病，而输入CD4
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CD25
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Treg细胞则可抑制疾病的发生。同时，Treg细胞还特异性表达转录因子FoxP3，FoxP3对于Treg发育和功能具有重要的调控作用，该基因突变可致Treg细胞发育、分化障碍和功能异常。此外，由于人体中活化的CD4
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T细胞也高表达CD25，因此，人们通常还会使用CD127作为补充标志以更准确的鉴定Treg细胞。
[0003]Treg细胞的免疫调节作用是通过细胞间直接接触和旁分泌作用实现的，其靶细胞主要是效应T细胞(Effector T cells，Teff)和树突状细胞(Dendritic cells，DC)。此外，也包括巨噬细胞、B细胞、NK细胞等。人体的免疫系统平衡正是由Treg细胞核Teff细胞来维持的，而一旦两者之间的平衡被打破，则会导致多种疾病的发生。Treg细胞数量过多与肿瘤、感染疾病等密切相关，而Treg细胞数量不足则会导致自身免疫性疾病。研究表明，在多种自身免疫性疾病中均出现了Treg细胞数量的减少或功能的异常。对Treg细胞的数目和功能的干预，可能是治疗多种自身免疫性疾病和炎症性疾病的针对性靶点。
[0004]人机体内Treg的数量非常少，外周血Treg细胞仅占CD4
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T淋巴细胞的5～10％，100mL外周血仅能分离纯化到106数量级的Treg细胞。目前常规的扩增方法需要较大的样本体积(250～400mL外周血)以及较长的扩增周期(3～4周)。扩增过程中还易出现FoxP3表达不稳定的情况，导致细胞活性降低，不利于临床应用。同时由于自身免疫性疾病患者体内的Treg细胞数量和功能异常，非常不利于自体Treg细胞的体外扩增。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术存在的问题提供了一种细胞扩增倍数高、抑制活性强的基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法及应用。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：
[0007]一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1：从脐血中分离单个核细胞；
[0009]步骤2：采用培养基将单个核细胞密度调整至0.5
×
106～2
×
106cells/mL，接种至培养瓶，添加CD3/CD28免疫磁珠、人AB血浆、IL-2；
[0010]接种脐带华通氏胶间充质干细胞，脐血单个细胞核数量：脐带华通氏胶间充质干细胞的数量比为2：1～10：1；
[0011]步骤3：第二天和第四天，分别补加培养基，并添加人AB血浆和IL-2；
[0012]步骤4：第六天，收集细胞，采用磁珠分选法分离CD4
+
CD25
+
CD127-Treg细胞；
[0013]步骤5：采用培养基将步骤4分离的Treg细胞调整至0.5
×
106～2
×
106cells/mL，接种至培养瓶中，添加优化扩增因子和CD3/CD28免疫磁珠；
[0014]步骤6：第八天、第十天和第十二天，分别补加培养基，并添加优化扩增因子；
[0015]步骤7：第十四天，收集脐血Treg细胞，进行质量检测后将脐血Treg细胞冻存；
[0016]所述优化扩增因子包括：人AB血浆、IL-2、雷帕霉素、RARA激动剂、DNA甲基转氨酶抑制剂。
[0017]进一步的，所述步骤2和步骤3中人AB血浆、IL-2加入量为：加入至其终浓度分别为人AB血浆5～10vol％，IL-2浓度为300～1000IU/ml。
[0018]进一步的，所述步骤5和步骤6中添加优化扩增因子后各组分终浓度为：人AB血浆5～10vol％，IL-2浓度为300～1000IU/mL，雷帕霉素浓度为10～100nmol/L，RARA激动剂浓度为1～10nmol/L，DNA甲基转移酶抑制剂浓度为1～10μmol/L。
[0019]进一步的，所述步骤2和步骤5中CD3/CD28免疫磁珠与细胞数量比为1：1～4：1。
[0020]进一步的，步骤7中冻存采用的冻存液按体积比包括：培养基50vol％、人AB血浆40vol％、二甲基亚砜10vol％。
[0021]进一步的，所述步骤1中脐血单个核细胞的分离方法为：将脐血与PBS缓冲液按1：2体积比混合均匀，然后加入至等体积的分离液中，采用密度梯度离心法分离单个核细胞。
[0022]进一步的，所述步骤4中细胞分离方法如下：首先采用磁珠阴性分选法去除CD4-细胞，然后采用磁性阳性分选法富集CD25
+
细胞。
[0023]进一步的，所述步骤7中扩增后脐血Treg细胞的扩增倍数为1400～3800。
[0024]一种脐血Treg细胞，所述脐血Treg细胞CD4
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CD25
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阳性率大于90％，FoxP3阳性率大于80％，HLA-DR阳性率低于5％，效靶比1：1时脐血Treg细胞对于CD8
+
T细胞增殖的抑制率大于80％。
[0025]一种脐血Treg细胞在制备治疗免疫性疾病药物中的应用，所述免疫性疾病为自身免疫性疾病和移植物抗宿主病，自身免疫性疾病为多发性硬化症、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、牛皮癣的一种。。
[0026]本专利技术的有益效果是：
[0027](1)本专利技术采用脐带华通氏胶间充质干细胞作为滋养层细胞，可以诱导Treg细胞分化和扩增，提高单个核细胞中Treg细胞比例，有利于后续的磁珠分选和细胞快速扩增；
[0028](2)本专利技术采用人AB血浆、IL-2、雷帕霉素、RARA激动剂、DNA甲基转氨酶抑制剂作为优化扩增因子，可以维持FoxP3的稳定表达，增强脐血Treg细胞的活性；
[0029](3)本专利技术采用脐血作为Treg细胞扩增的原料，可批量制备并减少因样本个体差异导致的Treg细胞质量波动；
[0030](4)本专利技术得到的脐血Treg细胞免疫原性很低，可作为通用型细胞用于临床研究。
附图说明
[0031]图1为本专利技术方法流程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：从脐血中分离单个核细胞；步骤2：采用培养基将单个核细胞密度调整至0.5
×
106～2
×
106cells/mL，接种至培养瓶，添加CD3/CD28免疫磁珠、人AB血浆、IL-2；接种脐带华通氏胶间充质干细胞，脐血单个细胞核数量：脐带华通氏胶间充质干细胞的数量比为2：1～10：1；步骤3：第二天和第四天，分别补加培养基，并添加人AB血浆和IL-2；步骤4：第六天，收集细胞，采用磁珠分选法分离CD4
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CD25
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CD127-Treg细胞；步骤5：采用培养基将步骤4分离的Treg细胞调整至0.5
×
106～2
×
106cells/mL，接种至培养瓶中，添加优化扩增因子和CD3/CD28免疫磁珠；步骤6：第八天、第十天和第十二天，分别补加培养基，并添加优化扩增因子；步骤7：第十四天，收集脐血Treg细胞，进行质量检测后将脐血Treg细胞冻存；所述优化扩增因子包括：人AB血浆、IL-2、雷帕霉素、RARA激动剂、DNA甲基转氨酶抑制剂。2.根据权利要求1所述的一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3中人AB血浆、IL-2加入量为：加入至其终浓度分别为人AB血浆5～10vol％，IL-2浓度为300～1000IU/ml。3.根据权利要求1所述的一种基于滋养层细胞的脐血Treg细胞体外扩增方法，其特征在于，所述步骤5和步骤6中添加优化扩增因子后各组分终浓度为：人AB血浆5～10vol％，IL-2浓度为300～1000IU/mL，雷帕霉素浓度为10～100nmol/L，RARA激动剂浓度为1～10nmol/L，DNA甲基转...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇军，刘少先，
申请(专利权)人：成都云测医学生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：