盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用技术方案

本发明专利技术公开了一株GETV毒株(GETV

【技术实现步骤摘要】
盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用。

技术介绍

[0002]盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)成员。甲病毒基因组5ˊ末端的前2/3部分编码非结构蛋白，称为非结构区，该区共编码4种非结构蛋白(nsp1-nsp4)，而靠近3ˊ末端的后1/3称为结构区，编码数种结构蛋白，这些结构蛋白由亚基因组mRNA翻译得到，其包括衣壳蛋白(C)、膜糖蛋白E1、E2、E3以及6K蛋白等。
[0003]研究证明，盖他病毒可引起赛马急性发热，后肢伴有麻疹和肿胀。GETV引起猪的疾病时，幼猪症状表现为精神不振、食欲减退或消失、全身震颤、体温升高、腹泻、体表发红、共济失调等，严重者还可出现神经症状，甚至衰竭死亡，但是，耐受强的仔猪则无临床症状。怀孕母猪感染盖他病毒后一般不出现临床症状，但会引起繁殖障碍，导致胚胎死亡并被吸收，从而降低母猪产仔数，妊娠前期感染该病毒可导致胚胎死亡，母猪返情，产死胎等。
[0004]1955年首次从马来西亚雪背库蚊(Culex gelidus)中分离到该病毒。血清学检测结果显示，GETV广泛分布于欧洲、亚洲和大洋洲，在猪、马、牛及袋鼠等多种动物体内均检测到GETV抗体。日本自20世纪70年代以来已多次报告马和猪中的GETV感染，1990年印度报告马GETV感染暴发。在中国，自从在海南省首次从蚊虫中鉴定出GETV以来，一些单位开展在媒介昆虫、家畜的病毒分离，以及人和动物GETV血清学调查，结果显示，该病毒迅速传播，在我国东北、西北、西南以及华中广大地区的动物和人群血清中检测到GETV特异性IgM、IgG或中和抗体，并多次在动物中引起疫情，导致家畜感染和致死性疾病。
[0005]目前，盖他病毒已经成为危害畜牧业的一个潜在威胁。我国对盖他病毒研究起步晚，对其生物学特殊性、致病机理、诊断试剂等研究的还不够深入。我国尚未报道商品化疫苗的批量生产及使用，国外则有不少报道，如日本用于马的灭活苗、盖他-乙脑二联灭活疫苗，用于猪的弱毒活疫苗，盖他-乙脑-细小三联弱毒活疫苗，上述疫苗主要为弱毒苗且多用于马，但是其保护效率也因为毒株的变异而不一定有很好的保护力。盖他病毒基因工程疫苗尚未见到报道。
[0006]目前，已有多种RNA病毒(如脊髓灰质炎病毒、甲病毒、黄病毒、麻疹病毒、流感病毒等)被改造成病毒载体，其中甲病毒表达载体系统是最成功最具前景的RNA病毒载体。甲病毒载体具有许多优势，比如该病毒基因组结构更为简单，载体系统的构建和操作更为容易，病毒本身无广泛的免疫背景，不存在免疫耐受问题，且可感染分裂期细胞和作为抗原递呈细胞的树突状细胞，可望获得更好免疫效果。另外，甲病毒载体瞬时表达和基因不整合的特点使其在肿瘤治疗性疫苗和一些疾病的基因治疗研究中有广阔的前景，所有这些均使其成为新型疫苗研究的有力工具。以辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒为基础的甲病毒表达系统已经成为研究蛋白表达和蛋白修饰的有用工具，已经利用甲病毒
载体对大量的来自病毒、细菌的蛋白和肿瘤抗原进行了表达研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用，为深入开展GETV的基础和应用研究提供有效的平台。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一株盖他病毒，保藏编号为CCTCC NO：V 202069，命名为猪盖他病毒GETV-GX201808。
[0010]上述盖他病毒的全长感染性克隆，为该病毒基因组全长感染性克隆pGETV-GX。
[0011]pGETV-GX中病毒全长基因为序列表中SEQ.ID.No.27。
[0012]上述盖他病毒的复制子系统，为pGETV-rep-GFP。
[0013]pGETV-rep-GFP中重组病毒基因为序列表中SEQ.ID.No.29。
[0014]上述盖他病毒的全长感染性克隆或复制子系统在制备盖他病毒诊断试剂或盖他病毒基因工程疫苗方面的应用。
[0015]盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统的制备方法，包括以下步骤：
[0016](1)GETV-GX201808株基因组全序列的扩增；
[0017](2)pGETV-GX重组质粒的构建；
[0018](3)pGEE3GFP重组质粒的构建；
[0019](4)重组质粒pGETV-GX和pGEE3GFP的拯救；
[0020](5)盖他病毒复制子系统(pGETV-rep)的构建。
[0021]步骤(1)和(2)中，提取GETV-GX201808株的RNA，经过反转录得到cDNA，以cDNA为模板，分别用S1-S4扩增片段的引物通过PCR扩增得到S1-S4片段；以pBR322为模板，用PBR332PacⅠ381F/PBR332MluⅠ978R扩增得到A片段，将酶切位点PacⅠ、MluⅠ通过A片段插入pBR322载体中，得到pBR322-PM；通过引物CmvF/Cmv-X-M-N R扩增CMV片段，将CMV插入pBR322-PM；将S1通过酶切位点插入pBR322-PM，得到pBR322-PM-S1，将S2通过酶切位点插入pBR322-PM-S1，得到pBR322-PM-S12，将S3通过酶切位点插入pBR322-PM-S12得到pBR322-PM-S123，将S4通过酶切位点插入pBR322-PM-S123得到pBR322-PM-S1234，最后通过引物BGH-Mlu
Ⅰ-
F/BGH-Nru
Ⅰ-
R扩增BGH，得到片段D，将片段D插入pBR322-PM-S1234得到pGETV-GX；
[0022]步骤(3)中，以pGETV-GX为模板，用引物TY G BstbⅠF、ST-44-GFP-1R，GFP3UTRF、TY G MluI R，扩增得到片段B1、B3片段；用ST-44-GFP-2F、GFP3UTRR扩增GFP得到B2片段，将片段B1、B2、B3通过SOE-PCR得到片段B，将片段B插入pGETV-GX得到pGEE3GFP；步骤(4)中，pGETV-GX转染BHK-21细胞后，可拯救亲本病毒rGETV-GX；而pGEE3GFP转染BHK-21细胞后，可拯救重组病毒rGEE3GFP；
[0023]步骤(5)中，以pGEE3GFP为模板，用引物TY SwaⅠF，SOE GFP R和SOE GFP F，TY G MluI R扩增出C1与C2片段，将片段C1与C2通过SOE-PCR得到片段C，将片段C与pGEE3GFP同时酶切，将片段C替换插入pGEE3GFP，得到pGETV-rep-GFP，用引物CmvF/SOE G 5utr stru 1R、SOE G 5utr stru 2F/TY SrfI R通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株盖他病毒，保藏编号为CCTCC NO：V 202069，命名为猪盖他病毒GETV-GX201808。2.权利要求1所述盖他病毒的全长感染性克隆，其特征在于为该病毒基因组全长感染性克隆pGETV-GX。3.根据权利要求2所述盖他病毒的全长感染性克隆，其特征在于：所述pGETV-GX中病毒全长基因为序列表中SEQ.ID.No.27。4.权利要求1所述盖他病毒的复制子系统，其特征在于为pGETV-rep-GFP。5.根据权利要求4所述盖他病毒的复制子系统，其特征在于：所述pGETV-rep-GFP中重组病毒基因为序列表中SEQ.ID.No.29。6.权利要求2或4所述盖他病毒的全长感染性克隆或复制子系统在制备盖他病毒诊断试剂或盖他病毒基因工程疫苗方面的应用。7.一种盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)GETV-GX201808株基因组全序列的扩增；(2)pGETV-GX重组质粒的构建；(3)pGEE3GFP重组质粒的构建；(4)重组质粒pGETV-GX和pGEE3GFP的拯救；(5)盖他病毒复制子系统(pGETV-rep)的构建。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)和(2)中，提取GETV-GX201808株的RNA，经过反转录得到cDNA，以cDNA为模板，分别用S1-S4扩增片段的引物通过PCR扩增得到S1-S4片段；以pBR322为模板，用PBR332Pac
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381F/PBR332Mlu
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978R扩增得到A片段，将酶切位点Pac
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、Mlu
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通过A片段插入pBR322载体中，得到pBR322-PM；通过引物CmvF/Cmv-X-M-N R扩增CMV片段，将CMV插入pBR322-PM；将S1通过酶切位点插入pBR322...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：