基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法技术

本发明专利技术提供了一种基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法，包括以下步骤：S1：取背最长肌组织样本；S2：基于RNAseq技术，对组织样品单细胞所有RNA进行测序获得转录组数据；S3：转录组测序质量评价，若转录组测序的质量较高，则进行生物信息分析；S4：差异表达基因进行分析，绘制lncRNA

【技术实现步骤摘要】
基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法


[0001]本专利技术涉及驴肌肉发育相关基因挖掘
，具体而言，涉及一种基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法。

技术介绍

[0002]德州驴作为大型驴代表，具有耐粗饲、抵抗力高、抗病力强等特点。随着德州驴役用价值的弱化，如何加快养殖模式的变革，提高驴肉的生产成为重点。
[0003]骨骼肌是畜禽肉类的重要的组成的部分，肌纤维的数量和体积是影响肉质的关键因素，而骨骼肌的生长发育也是肉驴生产关注的问题。越来越多的研究表明非编码RNA(non
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coding RNA,ncRNA)在调控生物体的胚胎发育、组织分化、器官形成等生命活动扮演着重要的角色，并且对肌肉发育起重要的调控作用。
[0004]因此，探究驴肌肉组织的非编码RNA的表达谱、骨骼肌发育分子机制对德州驴役用性能转为肉用性能和专门化肉用新品种开发具有重要的指导意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决现有技术或相关技术中存在的技术问题之一。
[0006]为此，本专利技术的一个目的在于提供一种基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法，基于RNAseq技术，结合实时定量PCR技术、双荧光素酶基因报告系统等方法确定具有重要功能的靶基因，以便为肉用驴的选育提供理论依据，对德州驴役用性能转为肉用性能和专门化肉用新品种开发具有重要的指导意义。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案提供了一种基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法，包括以下步骤：
[0008]S1：选取遗传背景一致的2月龄、24月龄健康公驴各3头，屠宰后取背最长肌组织样本；
[0009]S2：基于RNAseq技术，从所述背最长肌组织样本中提取RNA，并对这些组织样品单细胞所有RNA进行测序整理分析获得转录组数据；
[0010]S3：采用HISAT2分层次索引比对工具，将总的待分析数据clean Reads比对到参考基因组上进行转录组测序质量评价，若转录组测序的质量较高，则可以进行后续的生物信息分析；
[0011]S4：对mRNAs、lncRNAs、small RNA与参考基因组进行比对，采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因，绘制lncRNA
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mRNA互作网络图，构建miRNA
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mRNA互作网络图；
[0012]S5：采用qRT
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PCR验证对差异表达基因lncRNA和mRNA进行验证，从预测的miRNA
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mRNA互作网络图中，随机地挑选几组进行验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，说明此次实验测序结果是可靠的；
[0013]S6：预测并筛选miRNA的靶基因，通过双荧光素酶报告试验验证miRNA与其预测靶
基因的关系，确定出TPM3和ZZZ3基因是miR
‑
1的靶基因。
[0014]优选地，步骤S4中，采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因，具体包括以下步骤：
[0015]采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选出P值小于0.05的GO和基因通路，GO注释说明基因的基本功能，KEGG说明基因所参与的代谢通路；
[0016]设定差异表达基因的筛选条件，所述差异表达基因的筛选条件包括筛选指标FDR小于0.01，Log2FC大于1，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因，其中，对不同时期差异的mRNA和lncRNA进行筛选的筛选标准为P＜0.05，|Fold change|＞2，采取DESeq2(Love M I et al.2014)对差异miRNA进行定量分析，标准为p<0.05。
[0017]优选地，步骤S4中，绘制lncRNA
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mRNA互作网络图，构建miRNA
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mRNA互作网络图，具体包括：
[0018]lncRNA的功能预测：选择lncRNA上下游100kb间隔的编码基因作为顺式作用的靶基因，并对靶基因进行功能富集，以预测lncRNA的功能；
[0019]miRNA靶基因的预测：采用miRanda(Enright A J et al.2003)、PITA(Kertesz M et al.2007)和RNAhybrid(Kruger JRehmsmeier M 2006)对miRNA进行靶基因预测分析；
[0020]对选取差异的mRMA、miRNA、lncRNA的靶基因分别进行GO和KEGG富集分析；
[0021]lncRNA
‑
mRNA互作分析：采用顺式作用进行靶基因预测，发现有差异lncRNA对应的靶基因，之后在肌肉发育相关信号通路上，找寻相关的编码基因，然后将靶基因与编码基因作集合，将重复筛选的靶基因与差异mRNA进行比对，得到的靶基因与肌肉发育显著相关，构建lncRNA
‑
mRNA网络互作图；
[0022]miRNA
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mRNA互作分析：将得到的差异mRNA与miRNA的靶基因进行对比，构建miRNA
‑
mRNA网络互作图。
[0023]优选地，所述肌肉发育相关信号通路包括mTOR信号通路、wnt信号通路、AMPK信号通路中的一种或者几种。
[0024]优选地，步骤S5中，采用qRT
‑
PCR验证对差异表达基因lncRNA和mRNA进行验证中，定量引物通过Primer 5设计，再由NCBI Primer
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BLAST验证，而且对lncRNA
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mRNA靶向关系也进行定量验证；选择GAPDH作为内参基因，设计定量引物；依照2
‑△△ꢀ
ct
(Livak K JSchmittgen T D 2001)进行计算。
[0025]优选地，lncRNA的qRT
‑
PCR引物序列为：
[0026][0027][0028][0029]优选地，mRNA的qRT
‑
PCR引物序列为：
[0030][0031][0032]优选地，步骤S6中预测并筛选miRNA的靶基因，通过双荧光素酶报告试验验证miRNA与其预测靶基因的关系，具体包括：
[0033]以P<0.05和|Fold change|>2为筛选标准预测并筛选miRNA的靶基因；
[0034]选到6个miR
‑
1靶基因，之后构建IGF
‑
1、TMSB4X、EFS1、TPM3、PLXDC2和ZZZ3这6个预测靶基因野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体，并进行双荧光素酶试验。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：选取遗传背景一致的2月龄、24月龄健康公驴各3头，屠宰后取背最长肌组织样本；S2：基于RNAseq技术，从所述背最长肌组织样本中提取RNA，并对这些组织样品单细胞所有RNA进行测序整理分析获得转录组数据；S3：采用HISAT2分层次索引比对工具，将总的待分析数据clean Reads比对到参考基因组上进行转录组测序质量评价，若转录组测序的质量较高，则可以进行后续的生物信息分析；S4：对mRNAs、lncRNAs、small RNA与参考基因组进行比对，采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因，绘制lncRNA
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mRNA互作网络图，构建miRNA
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mRNA互作网络图；S5：采用qRT
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PCR验证对差异表达基因lncRNA和mRNA进行验证，从预测的miRNA
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mRNA互作网络图中，随机地挑选几组进行验证，若DEGs的表达模式与转录组测序结果一致，说明此次实验测序结果是可靠的；S6：预测并筛选miRNA的靶基因，通过双荧光素酶报告试验验证miRNA与其预测靶基因的关系，确定出TPM3和ZZZ3基因是miR
‑
1的靶基因。2.根据权利要求1所述的基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法，其特征在于，步骤S4中，采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因，具体包括以下步骤：采用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行分析，筛选出P值小于0.05的GO和基因通路，GO注释说明基因的基本功能，KEGG说明基因所参与的代谢通路；设定差异表达基因的筛选条件，所述差异表达基因的筛选条件包括筛选指标FDR小于0.01，Log2FC大于1，获得得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因，其中，对不同时期差异的mRNA和lncRNA进行筛选的筛选标准为P＜0.05，|Fold change|＞2，采取DESeq2(Love MI et al.2014)对差异miRNA进行定量分析，标准为p<0.05。3.根据权利要求1所述的基于RNAseq技术的驴肌肉发育相关基因挖掘调控方法，其特征在于，步骤S4中，绘制lncRNA
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mRNA互作网络图，构建miRNA
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mRNA互作网络图，具体包括：lncRNA的功能预测：选择lncRNA上下游100kb间隔的编码基因作为顺式作用的靶基因，并对靶基因进行功能富集，以预测lncRNA的功能；miRNA靶基因的预测：采用miRanda(Enright A J et al.2003)、PITA(Kertesz M et al.2007)和RNAhybrid(Kruger JRehmsmeier M 2...

【专利技术属性】
技术研发人员：于杰，尹桂军，李海静，王延涛，嵇传良，李敏，李雪贤，吴帅帅，刘冰，王涛，李世鹏，张友鑫，
申请(专利权)人：东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：