免疫疗法疫苗的制备方法技术

本文提供用于癌症免疫疗法的疫苗的制备方法。外泌体在常温放置一定时间以上时，膜结构发生崩溃，不能与树突细胞融合。因此，需要在促进蛋白质转化为肽并且维持外泌体膜结构的条件下进行加热处理，该条件为56℃以下并且30分钟以下。在其以上的温度条件，蛋白质发生变性，不能保持抗原性。因此，通过将从癌症患者的癌细胞或血液等体液分离的外泌体(Exosome)在56℃以下并且30分钟以下的条件进行加热处理，促进外泌体内的蛋白质酶失活，使蛋白质降解酶及脂质降解酶失活。然后将该外泌体导入从癌症患者或健康人的血液等诱导的树突细胞或与所述树突细胞共培养。述树突细胞共培养。述树突细胞共培养。

【技术实现步骤摘要】
免疫疗法疫苗的制备方法


[0001]本专利技术涉及在使用癌细胞的外泌体和树突细胞的免疫疗法中使用的树突细胞疫苗的制备方法。

技术介绍

[0002]对免疫疗法而言，存在以癌细胞产生的特定的蛋白质作为标志提呈特异性抗体，产生攻击癌细胞的免疫细胞(CTL)的疗法(获得性免疫)，以及识别异物蛋白质而进行排除异物(自然免疫)两种疗法。
[0003]在至今为止的免疫疗法中，使从患者的血液单核细胞等分离的树突细胞(DC：dendritic cell)与从患者得到的癌细胞(也包括癌前细胞)融合，将该融合细胞单独或与刺激细胞毒性T细胞应答、体液免疫应答的细胞因子一起通过皮下注射等进行施用。
[0004]在该以往的免疫疗法的情况下，树突细胞和癌细胞的融合效率低，为10％左右，因此，施用的疫苗的抗原呈递效率差。另一方面，使用外泌体而被DC摄入时，相对于105个DC，能够获得外泌体的数量为108～109个，在大部分的DC中摄入外泌体。
[0005]另外，正常的成熟树突细胞来源的外泌体和NK细胞来源的外泌体等导致癌细胞增殖的阻碍，调节性T细胞(Treg)的阻碍，MDSC的阻碍，血管生成的阻碍，而在破坏癌组织的方向发挥功能。因此，成熟树突细胞来源的外泌体和NK细胞来源的外泌体等正用于癌症治疗中。
[0006]另一方面，癌细胞来源的外泌体存在使癌细胞恶化而使其基因发生突变的倾向。另外，造成阻止癌细胞增殖的免疫细胞的失活。在这种情况下，癌细胞会从构成疫苗的树突细胞的抗原呈递功能下逃出，即使融合细胞作为抗原呈递细胞(APC)发挥作用，诱导细胞毒性T细胞(CTL)，自然杀伤细胞(NK)，CTL的活性、NK活性也丧失，失去抗癌活性。即，由于癌细胞从免疫疗法下逃出，释放癌细胞来源的外泌体，频繁使其基因发生突变，且使免疫细胞的活性失活。尚没有建立对此有效的应对方法。
[0007]作为解决如树突细胞和癌细胞的融合效率较低这样的现有问题的现有技术，提出专利文献1。在该专利文献1中，公开了将从癌细胞释放的外泌体(exosome)通过电穿孔处理(electroporation)插入树突细胞、T细胞等免疫细胞中，将经该电穿孔处理的细胞(疫苗)施用于患者。
[0008]根据专利文献1，癌细胞的基因经常变化，癌细胞使基因突变则癌细胞表达的蛋白质也发生变化，从抗原呈递中逃出。细胞来源的外泌体维持与作为分泌来源的细胞相同的蛋白质和功能。不仅正常的成熟树突细胞来源的或NK细胞来源的外泌体，从癌细胞释放的外泌体也携带与分泌来源的癌细胞相同的蛋白质，即抗原。即，在使用癌细胞来源的外泌体的情况下，即使癌细胞的基因发生突变，在发生突变的癌细胞来源的外泌体中，也携带与发生突变的癌细胞相同的抗原。
[0009]即，将癌细胞来源的外泌体作为抗原使用时，即使癌细胞基因发生变化而使表达的蛋白质发生变化，其蛋白质也与癌细胞来源的外泌体具有的蛋白质相同，因此，癌细胞不
能从抗原呈递下逃脱。
[0010]另外，在非专利文献1及非专利文献2中公开了通过将癌细胞来源的外泌体进行脉冲导入树突细胞中，由此该树突细胞对患者的T细胞诱导自身肿瘤细胞的细胞毒活性。
[0011]进一步，在非专利文献3中记载了经过用白血病细胞来源的外泌体刺激的树突细胞诱导针对白血病细胞的细胞毒性T淋巴细胞免疫反应。
[0012]现有技术文献
[0013]专利文献
[0014]专利文献1：日本特表2013-523824号公报
[0015]非专利文献
[0016]非专利文献1：日本外科学会杂志，2005年，vol.106，临时增刊号，p.195，摘要No.SF2309-2
[0017]非专利文献2：Biotherapy，2004年，vol.18，Suppl.1，p.116，摘要No.p-27
[0018]非专利文献3：PLOS ONE，2004年，vol.9，no.3，e91463，p.1-7

技术实现思路

[0019]专利技术所要解决的问题
[0020]如果使从癌细胞释放的外泌体与树突细胞(DC：dendritic cell)融合，将该融合的细胞作为疫苗施用于患者，则即使癌细胞基因发生突变，该疫苗也不丧失作为抗原呈递细胞(APC)的功能。从而，现有技术文献公开的方法有效。
[0021]已判明抗原呈递的机理为与癌细胞特异性的蛋白质在细胞内被分解为肽，该肽与存在于癌细胞表面的MHC分子结合而作为抗原肽被提呈，细胞毒性T细胞(CTL)识别该抗原肽而攻击癌细胞。
[0022]然而，外泌体内的蛋白质分解为肽需要时间，免疫反应并不容易发生。即，存在即使从癌细胞释放的外泌体与树突细胞融合，到作为疫苗发挥效果也需要时间的问题。
[0023]另外，存在外泌体不能长期保存的问题。与树突细胞融合的外泌体必需是维持膜结构的颗粒。然而，由于在常温中经过一定时间膜结构崩溃，因此无法保存。
[0024]如果在极低温度例如-96℃进行冻存则能够长期保存，但在制作疫苗时必须进行融解，如果反复融解，则此时存在膜发生损坏而不再保有作为颗粒的结构的情况。也考虑不进行冻存而是在4℃左右的低温进行保存。然而，与具有膜结构的病毒(流感，副流感，疱疹病毒)等颗粒同样，在1个月左右失活(99％)，颗粒被破坏，抗原呈递效率变差。无法制成蛋白质。
[0025]解决问题的手段
[0026]对外泌体而言，可在癌细胞恶化的同时与其母细胞具有相同的抗原。因此，具有相对于其突变有效的抗原呈递。
[0027]本专利技术涉及的癌症免疫疗法疫苗的制备方法从癌细胞(包括癌干细胞)的培养上清液、癌症患者的血液、腹水等体液分离外泌体，将该分离的外泌体通过加热处理而失活，将该失活的外泌体导入树突细胞进行融合。
[0028]如上所述，外泌体在常温放置一定时间以上时，膜结构发生崩溃，不能与树突细胞融合。因此，需要利用促进蛋白质转化为肽并且维持外泌体膜结构的条件进行加热处理，该
条件为56℃以下并且30分钟以下。在其以上的温度条件，蛋白质发生变性，不能保持抗原性。
[0029]本专利技术涉及的用于癌症免疫疗法的疫苗的制备方法中，作为使从癌细胞、患者的体液等分离的外泌体导入树突细胞的手段，可以使用电穿孔法，PEG(聚乙二醇)法，仙台病毒法。
[0030]在使用电穿孔法的情况下，认为由于在瞬间摄入，另外，在1ml的末期癌症患者的血清中存在109个以上的外泌体颗粒，因此被树突细胞的摄入率为90％以上。因此，认为与以往的使树突细胞和癌细胞融合的情况相比，抗原呈递细胞(APC)大幅增加。
[0031]另外，外泌体不仅能从癌症患者的血液分离，也能够从尿、腹水等体液分离。
[0032]专利技术的效果
[0033]可列举根据本专利技术而抗原呈递功能提高的效果。如上所述，癌细胞特有的蛋白质(外泌体内的蛋白质)被分解为肽，其与MHC分子结合而作为抗原肽提呈给细胞毒性T细胞(CTL)，一般而言，蛋白质为了保持生理活性，而以不成为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.免疫疗法疫苗的制备方法，其特征在于将从癌症患者的癌细胞或血液等体液分离的外泌体(Exosome)在56℃并且30分钟的条件下加热处理，促进外泌体内的蛋白质降解酶失活，然后将该外泌体导入从癌症患者或健康人血液等诱导的树突细胞或与所述树突细胞共培养作为抗原呈递细胞。2.免疫疗法疫苗的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：佐久间真俊，大园三千代，冈惠理子，
申请(专利权)人：锦高资本株式会社，
类型：发明
国别省市：