一种制备蝎子毒素多肽的方法技术

本发明专利技术提出了制备蝎子毒素多肽的方法，所述方法包括：提供第一多肽和第二多肽；将所述第一多肽和第二多肽进行连接，得到第三多肽；将所述第三多肽进行复性，得到蝎子毒素多肽；其中，所述复性步骤中采用的复性试剂选自二甲基亚砜、乙酸和水的混合液。本发明专利技术的方法制备的蝎子毒素多肽产量大，纯度高，收率高，且该方法操作简便、快捷、成本低，适于规模化生产。适于规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种制备蝎子毒素多肽的方法


[0001]本专利技术涉及医药领域，具体地，本专利技术涉及制备蝎子毒素多肽的方法。

技术介绍

[0002]在古巴，有一种蝎子名为Cuban blue scorpion Rhopalurus junceus，该蝎子的毒液经常被当地人用作抗癌的天然产物。此毒液也具有较好的抗菌活性。因此该毒素蛋白具有药物开发的潜能。经分析，此毒素中的主要成分为一种名为RjAa12f的化合物，它是含有64个氨基酸残基和四对二硫键的多肽。
[0003]目前获得蝎子毒素主要是直接从蝎子来源的粗毒中提取，经过反相高效液相色谱C18柱分离纯化。这种方法可以获得天然蝎子毒素多肽，但是缺点在于得到的蝎毒素量非常微小，同时不便于大规模生产操作。
[0004]因此，提供一种制备高产量、高纯度和收率的蝎子毒素多肽的方法显得很有必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提出了制备蝎子毒素多肽的方法，该方法制备的蝎子毒素多肽产量大，纯度高，收率高，且该方法操作简便、快捷、成本低，适于规模化生产。
[0006]本专利技术提出了一种制备蝎子毒素多肽的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：提供第一多肽和第二多肽；将所述第一多肽和第二多肽进行连接，得到第三多肽；将所述第三多肽进行复性，得到蝎子毒素多肽；其中，所述复性步骤中采用的复性试剂选自二甲基亚砜、乙酸和水的混合液。
[0007]专利技术人对复性步骤进行大量的研究，发现二甲基亚砜具有一定的氧化性，可以促进二硫键的形成，且酸性环境能加速多肽在二甲基亚砜中的复性反应。另外，二甲基亚砜还有助于多肽的溶解和防止多肽在溶液中发生聚集。由此，所筛选的复性试剂可以促进第三多肽中的巯基配对以形成二硫键，复性效率高，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高、产量大。
[0008]根据本专利技术的实施例，所述二甲基亚砜、乙酸和水的体积比为(8～12)：(1～3)：(18～22)。专利技术人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可以进一步提高复性效率，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
[0009]根据本专利技术的实施例，基于1mg所述第三多肽，所述复性试剂的添加量为0.4～0.8mL。由此，可以进一步提高复性效率，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述复性的时间为8～16小时。由此，可以进一步提高复性效率，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述蝎子毒素多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含如下四对二硫键：Cys11-Cys63、Cys15-Cys37、Cys22-Cys44、Cys26-Cys46。即，在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第11位Cys与63位Cys之间形成二硫键、第15位Cys与37位Cys之间形成二硫键、第22位Cys与44位Cys之间形成二硫键、第26位Cys与46位
Cys之间形成二硫键。
[0012]SEQ ID NO：1：KEGYPMGRDGCKISCVINNNFCKVECQAKWRQSDGYCYFWGLSCYCTNLPEDAQVWDSSTNKCG
[0013]根据本专利技术的实施例，所述第一多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述第二多肽具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。蝎子毒素多肽序列分成上述序列的第一多肽和第二多肽，将第一多肽和第二多肽连接后，第一多肽和第二多肽中含有的巯基在复性步骤中可以较好地进行配对以形成二硫键，复性效率高，所得蝎子毒素多肽纯度高、收率高。
[0014]SEQ ID NO：2：KEGYPMGRDGCKISCVINNNFCKVECQAKWRQSDGY
[0015]SEQ ID NO：3：CYFWGLSCYCTNLPEDAQVWDSSTNKCG
[0016]根据本专利技术的实施例，采用如下方式将所述第一多肽和第二多肽进行连接，得到第三多肽：将所述第一多肽与NaNO2在盐酸胍缓冲液中于-12～-18℃下反应15～25分钟，得到第一反应液；将所述第一反应液与4-巯基苯基乙酸(简称MPAA)混合，然后调节pH值至5～6，得到第二反应液；将所述第二反应液与所述第二多肽进行混合，并调节pH值至6.5～7，搅拌8～16小时，得到所述第三多肽。专利技术人采用自然化学连接方法将第一多肽和第二多肽连接成全长多肽，即第三多肽，并对上述工艺条件进行大量的筛选，由此，所得第三多肽的合成效率高，操作简便、快捷，成本低。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述第一多肽、第二多肽、NaNO2和4-巯基苯基乙酸的当量比为1：(1～2)：(3～7)：(30～70)。专利技术人经过大量实验得到上述较优配比，由此，可以进一步提高第三多肽的合成效率。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述盐酸胍缓冲液的浓度为4～8mol/L，所述第一多肽在所述盐酸胍缓冲液中的终浓度为6～10mM。由此，可以进一步提高第三多肽的合成效率。
[0019]根据本专利技术的实施例，将所述第一多肽和第二多肽进行连接之前，采用高效液相色谱分别对所述第一多肽和第二多肽进行纯化。由此，可以有效提高第一多肽和第二多肽的纯度，在后续的反应步骤中，避免其他杂质干扰，所得第三多肽及蝎子毒素多肽的收率高、纯度高。
[0020]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0021]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0022]图1显示了根据本专利技术一个实施例的实施例1的色谱图；
[0023]图2显示了根据本专利技术一个实施例的实施例1的质谱图；
[0024]图3显示了根据本专利技术一个实施例的实施例2的色谱图；
[0025]图4显示了根据本专利技术一个实施例的实施例2的质谱图；
[0026]图5显示了根据本专利技术一个实施例的实施例3的色谱图；
[0027]图6显示了根据本专利技术一个实施例的实施例3的质谱图；
[0028]图7显示了根据本专利技术一个实施例的实施例4的色谱图；
[0029]图8显示了根据本专利技术一个实施例的实施例4的质谱图；
[0030]图9显示了根据本专利技术一个实施例的对照例1的色谱图；
[0031]图10显示了根据本专利技术一个实施例的对照例2的色谱图；
[0032]图11显示了根据本专利技术一个实施例的对照例3的色谱图。
具体实施方式
[0033]下面将结合实施例对本专利技术的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0034]实施例1第一多肽的制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备蝎子毒素多肽的方法，其特征在于，包括：提供第一多肽和第二多肽；将所述第一多肽和第二多肽进行连接，得到第三多肽；将所述第三多肽进行复性，得到蝎子毒素多肽；其中，所述复性步骤中采用的复性试剂选自二甲基亚砜、乙酸和水的混合液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二甲基亚砜、乙酸和水的体积比为(8～12)：(1～3)：(18～22)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于1mg所述第三多肽，所述复性试剂的添加量为0.4～0.8mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复性的时间为8～16小时。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蝎子毒素多肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含如下四对二硫键：Cys11-Cys63、Cys15-Cys37、Cys22-Cys44、Cys26-Cys46。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一多肽具有SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭晓奇，杨杰，张玲员，周莉，
申请(专利权)人：合肥科生景肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：