利用可编程碱基编辑器系统编辑单核苷酸多态性的方法技术方案

本申请的特征在于一种用于改变与Rett综合症(RTT)相关的突变的组合物和方法。本申请提供组合物和使用碱基编辑器的方法，所述碱基编辑器包括多核苷酸可编程核苷酸结合结构域以及结合指导多核苷酸的核碱基编辑结构域。本申请还提供一种用于编辑靶核苷酸序列的核碱基的碱基编辑器系统。基的碱基编辑器系统。基的碱基编辑器系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用可编程碱基编辑器系统编辑单核苷酸多态性的方法
[0001]相关申请
[0002]本申请主张2018年5月11日提交的美国临时申请号62/670,588，2018年12月17日提交的美国临时申请号62/780,838和2019年3月13日提交的美国临时申请62/817,986的优先权和利益，其整体内容通过引用并入本文。

技术介绍

[0003]Rett综合征(RTT或RETT)是由甲基CpG结合蛋白2(Mecp2)基因中的一组异质突变引起的，这些突变削弱或消除了编码蛋白修饰中枢神经系统(CNS)中染色质和转录状态的能力。当在整个中枢神经系统中广泛传播时，提供功能性Mecp2的基因疗法或使用RNA编辑修复内源性Mecp2 mRNA转录物是有希望的治疗干预方法。但是，两种方法都必须克服重大挑战才能达到治疗效果。Mecp2基因疗法必须严格控制每细胞递送基因的剂量，否则有模仿Mecp2复制综合征表型的风险。RNA编辑平台无法准确校正占RTT诊断超过45％的最普遍的Mecp2突变，并且无法诱导有效的，不受指导的脱靶编辑。
[0004]Mecp2中引起Rett综合症(RTT)的基因突变是高度异质的。因此，一种受人欢迎的治疗策略是递送重组腺相关病毒(rAAV)携带的野生型Mecp2。因为所述策略与每个个体的因果突变无关，所以成功的基因治疗方法将为大部分RTT患者群体提供治疗选择。然而，迄今为止，所述策略已经取得了有限的成功。RTT患者几乎总是杂合的女性，由于随机的X染色体失活，导致中枢神经系统(CNS)内具有特征性的野生型和突变X染色体MeCP2镶嵌表达。因此，已经表达野生型MeCP2的神经元中的rAAV传递和野生型MeCP2的表达可能部分模拟MeCP2复制综合征的表型。与此一致的是，RTT模型小鼠中枢神经系统的高转导效率导致MeCP2表达比野生型小鼠高约2倍。
[0005]因此，需要用于治疗Rett综合征的新颖组合物和方法。
[0006]参考文献援引
[0007]本申请说明书中提到的所有出版、专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，如同明确地和独立地指出个别独立的出版物、专利或专利申请通过引用并入。除非另有说明，否则本说明书中提及的出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。

技术实现思路

[0008]如本文所述，本申请的特征在于一种使用可编程核碱基编辑器精确校正病原性氨基酸的组合物和方法。特别地，本申请的组合物和方法可用于治疗Rett综合征(RTT)。因此，本申请提供一种使用腺苷(A)碱基编辑器(ABE)来精确校正内源性Mecp2基因中的单核苷酸多态性，以校正有害突变(例如R133C、T158M、R255*、R270*、R306C)。
[0009]一方面，本申请提供一种编辑包含与Rett综合症(RTT)相关的单核苷酸多态性(SNP)的MECP2多核苷酸的方法，所述方法包括使MECP2多核苷酸与碱基编辑器接触，所述碱基编辑器与一种或多种指导多核苷酸复合，其中碱基编辑器包括多核苷酸可编程DNA结合结构域和腺苷脱氨酶结构域，并且其中一种或多种指导多核苷酸靶向碱基编辑器，以造成
与RTT相关的SNP的A
·
T到G
·
C改变。
[0010]另一方面，本申请提供了通过向细胞或其祖细胞中引入碱基编辑器或编码所述碱基编辑器的多核苷酸至所述细胞而产生的细胞，其中所述碱基编辑器包括多核苷酸可编程DNA结合域和腺苷脱氨酶域；以及靶向碱基编辑器的一种或多种指导性多核苷酸，以造成与RTT相关的SNP的A
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T到G
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C改变。
[0011]另一方面，本申请提供了一种在受试者中治疗RTT的方法，所述方法包括向所述受试者施用：碱基编辑器或编码所述碱基编辑器的多核苷酸给所述受试者，其中所述碱基编辑器包括多核苷酸可编程DNA结合域和腺苷脱氨酶域；以及靶向碱基编辑器的一种或多种指导性多核苷酸，以造成与RTT相关的SNP的A
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T到G
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C改变。
[0012]在另一方面，本申请提供了碱基编辑器，其包括：(i)修饰的SpCas9，其包含L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、R1335V、T1337R和L1111、D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、D1332A、R1335Q、T1337、T1337L、T1337Q、T1337I、T1337V、T1337F和T1337M中的一个或多个的氨基酸取代，或其相应的氨基酸取代；(ii)腺苷脱氨酶。
[0013]在另一方面、本申请提供了碱基编辑器，其包括：(i)修饰的SpCas9，其包含D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、A1322R、R1335Q和T1337、以及L1111R、G1218R、E1219F、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、T1337L、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337R、T1337H、T1337s和T1337M中的一个或多个的氨基酸取代，或其相应的氨基酸取代(ii)腺苷脱氨酶。
[0014]在各种实施方案中，接触是在细胞、真核细胞、哺乳动物细胞或人类细胞中。在各种实施方案中，细胞是体内或离体的。在各种实施方案中，所述改变是R106W、R168*、R133C、T158M、R255*、R270*和R306C中的一个或多个。在各种实施方案中，与RTT相关的SNP处的A
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T至G
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C改变将甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)多肽中的半胱氨酸变为精氨酸，蛋氨酸变为苏氨酸，或终止密码子变为精氨酸。在各种实施方案中，与RTT相关的SNP导致Mecp2多肽的表达，所述Mecp2多肽包含在氨基酸位置168、133、255、270或306处的精氨酸。或在位置158上苏氨酸。在各种实施方案中，多核苷酸可编程DNA结合结构域是化脓性链球菌Cas9(SpCas9)或其变体。在各种实施方案中，多核苷酸可编程DNA结合结构域包含具有改变的原间隔物相邻基序(PAM)特异性的修饰的SpCas9。在各种实施方案中，改变的PAM对核酸序列5
’‑
NGT
‑3’
具有特异性。在各种实施方案中，修饰的SpCas9包含L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、R1335V、T1337R和L1111、D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、D1332A、D1332S、D1332T、D2V2L D1332K、D1332R、R1335Q、T1337、T1337L、T1337Q、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337H、T1337Q和T1337M中的一个或多个的氨基酸取代，或其相应的氨基酸取代。在各个实施方案中、修饰的SpCas9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编辑包含与Rett综合征(RTT)相关的单核苷酸多态性(SNP)的MECP2多核苷酸的方法，所述方法包括使所述MECP2多核苷酸与一种或多种指导多核苷酸复合的碱基编辑器接触，其中所述碱基编辑器包括多核苷酸可编程DNA结合结构域和腺苷脱氨酶结构域，其中一种或多种所述指导多核苷酸靶向所述碱基编辑器，以造成与RTT相关的SNP的A
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T至G
·
C改变。2.根据权利要求1的方法，其中所述接触是在细胞、真核细胞、哺乳动物细胞或人类细胞中。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述细胞是体内的。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞是离体的。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述改变是R106W、R168*、R133C、T158M、R255*、R270*和R306C中的一个或多个。6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中于所述与RTT相关的SNP处的所述A
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T到G
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C改变将使甲基CpG结合蛋白2(Mecp2)多肽中的半胱氨酸变为精氨酸，蛋氨酸变为苏氨酸，或终止密码子变为精氨酸。7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述与RTT相关的SNP导致Mecp2多肽的表达，其中所述Mecp2多肽包含在氨基酸位置第168、133、255、270或306处的精氨酸或第158处的苏氨酸。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域是化脓性链球菌Cas9(SpCas9)或其变体。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含具有改变的原间隔物相邻基序(PAM)特异性的修饰的SpCas9。10.根据权利要求9的方法，其中所述修饰的SpCas9对核酸序列5
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NGT
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具有特异性。11.根据权利要求10的方法，其中所述修饰的SpCas9包含L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、R1335V、T1337R以及L1111、D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、R1335Q、T1337、T1337L、T1337Q、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337H、T1337Q和T1337M中的一个或多个的氨基酸取代，或其相应的氨基酸取代。12.根据权利要求10的方法，其中所述修饰的SpCas9包含D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、A1322R、R1335Q和T1337、以及L1111R、G1218R、E1219F、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、T1337L、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337R、T1337H、T1337Q和T1337M中的一个或多个的氨基酸取代，或其相应的氨基酸取代。13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域是核酸酶失活或切口酶变体。14.根据权利要求13的方法，其中切口酶变体包含D10A的氨基酸取代或其相应的氨基酸取代。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述腺苷脱氨酶结构域能够使脱氧核糖核酸(DNA)中的腺苷脱氨。16.根据权利要求15的方法，其中所述腺苷脱氨酶是TadA脱氨酶。17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述TadA脱氨酶为TadA*7.10。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种指导RNA包括CRISPR RNA(crRNA)和反式编码的小RNA(tracrRNA)，其中crRNA包含与Mecp2核酸序列互补的核酸序列，所述Mecp2核酸序列包含与RTT相关的SNP。19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述碱基编辑器与包含Mecp2核酸序列互补的核酸序列的单链指导RNA(sgRNA)复合，其中所述Mecp2核酸序列包含与RTT相关的SNP。20.一种通过引入细胞或其祖细胞而产生的细胞：碱基编辑器、或连接至所述细胞编码所述碱基编辑器的多核苷酸，其中所述碱基编辑器包含多核苷酸可编程DNA结合结构域和腺苷脱氨酶结构域；以及一种或多种指导多核苷酸，其靶向碱基编辑器，以造成与RTT相关的SNP的A
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T到G
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C改变。21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是神经元。22.根据权利要求20或权利要求21所述的细胞，其中所述神经元表达Mecp2多肽。23.根据权利要求20至22中任一项所述的细胞，其中所述细胞来自患有RTT的受试者。24.根据权利要求20至23中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。25.根据权利要求20至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人类细胞。26.根据权利要求20至25中任一项所述的电池，其中所述改变是R106W、R168*、R133C、T158M、R255*、R270*和R306C中的一个或多个。27.根据权利要求20至26中任一项的细胞，其中于所述与RTT相关的SNP处的A
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T到G
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C改变将甲基CpG结合蛋白2(Mecp2)多肽中的半胱氨酸变为精氨酸，蛋氨酸变为苏氨酸，或终止密码子变为精氨酸。28.根据权利要求20至27中任一项所述的细胞，其中所述与RTT相关的所述SNP导致Mecp2多肽的表达，其中所述Mecp2多肽包含在氨基酸位置第168、133、255、270或306处的精氨酸，或第158处的苏氨酸。29.根据权利要求20至28中任一项所述的细胞，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域是化脓性链球菌Cas9(SpCas9)或其变体。30.根据权利要求20至29中任一项所述的细胞，其中所述多核苷酸可编程DNA结合结构域包含具有改变的原间隔物相邻基序(PAM)特异性的修饰的SpCas9。31.根据权利要求30的细胞，其中所述修饰的SpCas9对核酸序列5
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具有特异性。32.根据权利要求31所述的细胞，其中所述修饰的SpCas9包含L1111R、D1135V、G1218R、E1219F、A1322R、R1335V、T1337R以及L1111、D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、D1332A、D1332S、D1332T、D1332V、D1332L、D1332K、D1332R、R1335Q、T1337、T1337L、T1337Q、T1337I、T1337V、T1337F、T1337S、T1337N、T1337K、T1337H、T1337Q和T1337M中的一个或多个的氨基酸取代，或其相应的氨基酸取代。33.根据权利要求31所述的细胞，其中所述修饰的SpCas9包含D1135L、S1136R、G1218S、E1219V、A1322R、R1335Q和T1337、以...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：比姆医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：