布鲁顿氏酪氨酸激酶的基于TALEN和基于CRISPR/CAS的基因编辑制造技术

本公开提供了改善的基因组编辑组合物和用于编辑人类BTK基因的方法。本公开还提供了用于预防、治疗或缓解X

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】布鲁顿氏酪氨酸激酶的基于TALEN和基于CRISPR/CAS的基因编辑
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2018年4月27日提交的美国临时申请No.62/664,035的优先权，其通过引用整体并入本文。
[0003]电子提交的文本文件的描述
[0004]通过电子方式提交的文本文件的内容通过引用全文并入本文：序列表的计算机可读形式副本(文件名：SECH_001_01WO_ST25.txt，记录日期：2019年4月26日，文件大小为75千字节)。

技术介绍


[0005]本公开涉及改善的基因编辑组合物。更具体地，本公开涉及基于TALEN和基于CRISPR/Cas的基因编辑组合物，以及使用其来编辑布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)基因的方法。
[0006]相关领域的描述
[0007]X-连锁无丙种球蛋白血症是一种由布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)基因突变引起的罕见免疫缺陷。BTK基因中有600多种不同的突变与X-连锁无丙种球蛋白血症相关。这些突变中的大多数导致缺乏BTK蛋白。其他突变会改变单个蛋白质构建块(氨基酸)，这可导致异常BTK蛋白质产生，其迅速在细胞中分解。正常B的成熟和活化、BCR-介导的信号传导以及髓样细胞中的一些信号传导途径都需要BTK。缺乏功能性BTK的受试者主要具有未成熟的B细胞，最少的抗体产生，并且易于复发和威胁生命的感染。
[0008]现有的治疗包括减轻了这些感染的严重程度的终生静脉内免疫球蛋白疗法，并明智地使用抗生素治疗。造血细胞移植(HCT)是唯一可用的有潜力提供XLA治愈的方法。然而，由于难以找到HLA匹配的供体以及与GvHD相关的潜在毒性，大多数XLA患者未用这种方法治疗。尽管移植存活率有了显著改善，但治疗相关的死亡率风险已成为XLA的异基因HCT的障碍。已经开发了整合在天然近端BTK基因启动子的控制下编码BTK cDNA的自灭活慢病毒载体(LV)，并在人类XLA的小鼠模型中对其进行了评价。然而，与逆转录病毒和基于LV的基因疗法相关的插入诱变和基因表达失调存在巨大风险。
[0009]专利技术概述
[0010]本公开通常部分涉及介导人类BTK基因的基因编辑的基于TALEN或基于CRISPR的基因编辑系统，及其使用方法。
[0011]在各个实施方案中，基因编辑组合物包含切割人布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)基因中的靶位点的TALEN。
[0012]在某些实施方案中，TALEN包含具有选自包括以下的组的RVD的TAL效应子结构域：
[0013]a)T1-F RVDs HD NG HD NN NI HD NG NI NG NN NI NI NI NI HD NG；
[0014]b)T1-R RVDs HD NG NI NI NN NN HD HD NI NI NN NG HD HD NG；
[0015]c)T2-F RVDs NI NG HD NI NI NN NN NI HD NG NG NN NN HD HD NG；
[0016]d)T2-R RVDs NI HD HD NI NI HD NN NI NI NI NI NG NG NG NI HD HD NG；
[0017]e)T3-F RVDs NI NG NG NG HD HD NG NI NN HD HD NG NI NG NI NI HD NG；
[0018]f)T3-R RVDs NN NN HD NG NG HD NG NG NI NN NN NI HD HD NG NG NG；
[0019]g)T4-F RVDs HD HD NI NG NG NG NN NI NI NI HD NG NI NN NN NG；和
[0020]h)T4-R RVDs HD HD NG HD NI NG HD HD HD NG HD NG NG NN NN NG NG；以及
[0021]TAL效应子结构域能够结合靶位点T1、T2、T3或T4。
[0022]在各个实施方案中，基因编辑组合物包含Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸；引导-RNA(gRNA)；和包含功能性BTK基因或其片段的修复模板；并且基因编辑系统能够修复B细胞中的内源性BTK基因或掺入功能性BTK基因于B细胞的基因组中。
[0023]在某些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO:9-17所示的核苷酸序列。
[0024]在各个实施方案中，多核苷酸编码本文所述的基因编辑组合物。
[0025]在各个实施方案中，mRNA编码本文所述的基因编辑组合物。
[0026]在各个实施方案中，cDNA编码本文所述的基因编辑组合物。
[0027]在各个实施方案中，载体包含编码本文所述的基因编辑组合物的多核苷酸。
[0028]在各个实施方案中，细胞包含编码本文所述的基因编辑组合物的多核苷酸。
[0029]在各个实施方案中，细胞包含编码本文所述的基因编辑组合物的mRNA。
[0030]在各个实施方案中，细胞包含载体，所述载体包含编码本文所述的基因编辑组合物的多核苷酸。
[0031]在各个实施方案中，细胞包含本文所述的一种或多种基因组修饰。
[0032]在某些实施方案中，细胞是造血细胞。
[0033]在某些实施方案中，细胞是造血干细胞或祖细胞。
[0034]在某些实施方案中，细胞是CD34
+
细胞。
[0035]在某些实施方案中，细胞是CD133
+
细胞。
[0036]在另外的实施方案中，组合物包含本文所述的细胞。
[0037]在具体的实施方案中，组合物还包含生理上可接受的载体。
[0038]在各个实施方案中，编辑细胞中的BTK基因的方法包括将本文所述的基因编辑组合物、多核苷酸和载体中的一种或多种及供体修复模板引入至细胞中，其中基因编辑组合物的表达在BTK基因中的靶位点处产生双链断裂，并将供体修复模板通过双链断裂(DSB)位点处的同源介导的修复(HDR)掺入BTK基因中。
[0039]在某些实施方案中，BTK基因包含导致X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的一种或多种氨基酸突变或缺失。
[0040]在具体的实施方案中，细胞是造血细胞。
[0041]在具体的实施方案中，细胞是造血干细胞或祖细胞。
[0042]在具体的实施方案中，细胞是CD34
+
细胞。
[0043]在具体的实施方案中，细胞是CD133
+
细胞。
[0044]在具体的实施方案中，编码多肽的多核苷酸是mRNA。
[0045]在具体的实施方案中，将编码5
′-3′
外切核酸酶的多核苷酸引入细胞中。
[0046]在另外的实施方案中，将编码Trex2或其生物活性片段的多核苷酸引入细胞中。
[0047]在一些实施方案中，供体修复模板包含与DSB的BTK基因序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.基因编辑组合物，其包含切割人布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)基因中的靶位点的TALEN。2.如权利要求1所述的基因编辑组合物，其中所述TALEN包含具有选自以下的RVD的TAL效应子结构域：其中所述TAL效应子结构域能够结合靶位点T1、T2、T3或T4。3.基因编辑组合物，其包含：a)Cas蛋白或编码Cas蛋白的多核苷酸；b)引导-RNA(gRNA)；和c)包含功能性BTK基因或其片段的修复模板；其中所述基因编辑系统能够修复B细胞中的内源性BTK基因或将功能性BTK基因插入至B细胞的基因组中。4.如权利要求3所述的基因编辑组合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO:9至17所示的核苷酸序列。5.多核苷酸，其编码权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物。6.mRNA，其编码权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物。7.cDNA，其编码权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物。8.载体，其包含编码权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物的多核苷酸。9.细胞，其包含权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物。10.细胞，其包含编码权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物的多核苷酸。11.细胞，其包含权利要求8所述的载体。12.细胞，其包含由权利要求1至4中任一项所述的基因编辑组合物引入的一种或多种基因组修饰。13.如权利要求9至12中任一项所述的细胞，其中所述细胞是造血细胞。14.如权利要求9至13中任一项所述的细胞，其中所述细胞是造血干细胞或祖细胞。15.如权利要求9至14中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CD34
+
细胞。16.如权利要求9至15中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CD133
+
细胞。17.组合物，其包含权利要求9至16中任一项所述的细胞。18.组合物，其包含权利要求9至16中任一项所述的细胞和生理上可接受的载体。19.编辑细胞中的BTK基因的方法，其包括：将权利要求1至4中任一项所述的基因编辑
组合物、权利要求5所述的多核苷酸或权利要求8所述的载体；以及供体修复模板引入至所述细胞中，其中所述基因编辑组合物的表达在BTK基因中的靶位点处产生了双链断裂，并且所述供体修复模板通过双链断裂(DSB)的位点处同源介导的修复(HDR)掺入所述BTK基因中。20.如权利要求19所述的方法，其中所述BTK基因包含导致X-连锁的无丙种球蛋白血症(XLA)的一种或多种氨基酸突变或缺失。21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述细胞是造血细胞。22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞或祖细胞。23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD34
+
细胞。24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述细胞是CD133
+
细胞。25.如权利要求19至24中任一项所述的方法，其中编码所述多肽的...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫，
申请(专利权)人：西雅图儿童医院DBA西雅图儿童研究所，
类型：发明
国别省市：