有机溶剂法制备载药笼状蛋白制造技术

本发明专利技术公开了有机溶剂法制备笼状蛋白包载药物。本发明专利技术包载药物的笼状蛋白的制备方法，包括以下步骤：步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；和步骤(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液。本发明专利技术工艺通过非变性和非解聚的方式，避免笼状蛋白发生蛋白变性或者出现笼状蛋白结构缺损，载药效果稳定，通过本发明专利技术的方法获得的产品均一，稳定，成药性好。成药性好。

【技术实现步骤摘要】
有机溶剂法制备载药笼状蛋白


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种利用有机溶剂进行笼状蛋白载药的制备方法。

技术介绍

[0002]笼状蛋白是通过蛋白质组装形成的中空的蛋白粒子，天然笼状蛋白包括铁蛋白、病毒衣壳蛋白、小热休克蛋白和网格蛋白有被小泡等。其中，铁蛋白是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的天然铁贮存蛋白，具有独特的球形空壳结构和可逆自组装特性。
[0003]本专利技术人研究团队相继发现铁蛋白可以用于肿瘤的体外诊断(《Nature Nanotechnology》,2012)、肿瘤的体外诊断、体内治疗(《PNAS》，2014)、体内肿瘤多模成像(《ACS Nano》,2016)和穿越血脑屏障作为靶向治疗脑恶性脑瘤(《ACS Nano》，2018)，极大的拓宽了铁蛋白在诊断和治疗领域的应用潜力。
[0004]以铁蛋白来包载药物，除了铁蛋白自身具备肿瘤特异性靶向功能和穿越血脑屏障的优越性能外，与未包载的药物相比，铁蛋白包载药物还具有能够定点释放、降低药物副作用、减少药物用量、延长药效等优点。且铁蛋白自身热稳定好，因此铁蛋白包载药物稳定性高、药效稳定。另外，铁蛋白属于天然蛋白载体，其具有更好的生物相容性，其不会引发机体的免疫反应，且不会增加机体的代谢负担。
[0005]现有技术的方法中，含脲的包被体系容易造成铁蛋白变性；高压包药的方式则对包被设备、成本的要求高，且限制了对高压敏感的药物的应用；通过pH剧烈变化进行包药，容易导致重新组装后的铁蛋白部分不完整，有缺损。
专利技术内容
[0006]本专利技术要解决的技术问题是：现有方法或者过于剧烈，导致笼状蛋白变性，包被的后铁蛋白药物缺损，质量无法保障；或者包被成本高、工艺复杂，不容易产业化；或者包被后的药物不稳定，不利于成药。
[0007]本专利技术人为解决上述技术问题发现，通过在包药溶液中添加一定浓度的有机溶剂，使得笼状蛋白氨基酸分子间作用力被破坏，蛋白通道松散，从而使得药物更快进入笼状蛋白的空腔中，增加药物包载效率。有机溶剂的处理不会导致铁蛋白解聚，不会造成铁蛋白损失或者破损，是一种以温和方式兼顾包药效率/品质的新方法。在包药完成后，通过去除包药系统中的有机溶剂，笼状蛋白结构能够恢复其包药前的高级结构状态，从而实现温和自然、无损高效、均质稳定、低成本的包药。
[0008]具体来说，本专利技术提出了如下技术方案：
[0009]一种包载药物的笼状蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0010]步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；
[0011]和步骤(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液；
[0012]任选地，还包括步骤(c)：去除笼状蛋白笼外的游离药物和有机溶剂；
[0013]优选地，步骤(a)采用混合或者溶液置换的方式；
[0014]所述溶液置换采用如下一种或两种以上的工艺进行：
[0015]工艺A：通过透析的方式将笼状蛋白的溶液笼外溶液置换成为含有有机溶剂的溶液；
[0016]工艺B：通过离心过滤的方式；优选地，所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤，进一步优选地，所述超滤离心管截留分子量为50-150KD，优选100KD；
[0017]工艺C：通过凝胶过滤层析的方式；优选地，所述凝胶过滤层析的方式是使用Superdex 75pg凝胶柱过滤层析。
[0018]本专利技术的有益效果包括：
[0019]1.本专利技术工艺通过非变性和非解聚的方式，避免笼状蛋白发生蛋白变性或者出现笼状蛋白结构缺损，载药效果稳定。
[0020]2.通过本专利技术的方法获得的产品均一，稳定，成药性好。
[0021]下面结合附图和各个具体实施方式，对本专利技术及其有益技术效果进行详细说明。
附图说明
[0022]图1为未包载DOX的HFn的TEM照片，图中标尺为50nm。
[0023]图2为实施例1制备得到的HFn-DOX的TEM照片，图中标尺为50nm。
[0024]图3为未包载DOX的HFn的紫外吸收光谱图。
[0025]图4为实施例1制备得到的HFn-DOX的紫外吸收光谱图。
[0026]图5为实施例1中制备得到的HFn-DOX与Trf1的结合活性结果。
[0027]图6为未包载DOX的HFn、实施例1制备得到的HFn-DOX和游离阿霉素(图中DOX)的药物活性结果图。
具体实施方式
[0028]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。
[0029]在本说明书和下面的权利要求书中，术语被定义为具有以下含义:
[0030]铁蛋白：“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径12nm，内径8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”，未特别指明时，本文所述“铁蛋白”包括了“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选动物铁蛋白，进一步优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白(Fn)和马脾铁蛋白(HSF)。本文所述铁蛋白包括野生型铁蛋白、铁蛋白突变体、铁蛋白衍生物或重组铁蛋白；任选地，所述铁蛋白来源包括人、动物、植物、细菌；优选所述人来源的铁蛋白选自人H型铁蛋白和/或人L型铁蛋白；所述动物来源铁蛋白优选马脾铁蛋白；所述细菌来源铁蛋白优选激烈火球菌铁蛋白。
[0031]真核生物铁蛋白通常包括重链H亚基和轻链L亚基。在不同的种属和同一种属体内
不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。例如HSF是从马脾中提取的铁蛋白，马脾铁蛋白的H亚基和L亚基的比值为1/9。通过重组方式，也可以获得仅由24个H亚基组装成的“H铁蛋白(HFn)”或仅由24个L亚基组装成的“L铁蛋白(LFn)”。
[0032]在本专利技术中，HFn和LFn指由全由人24个H型亚基或全由人24个L型亚基组成的铁蛋白。人H型亚基的序列可参考GenBank Acession No:AAH66341.1，人L型亚基的序列可参考GenBank Acession No:NP_000137.2。
[0033]本专利技术所述的真核生物铁蛋白还包括植物体铁蛋白，所述的原核生物铁蛋白包括细菌、真菌的铁蛋白，如激烈火球菌铁蛋白。
[0034]笼状蛋白：“笼状蛋白”是指由氨基酸形成的具有内部中央空腔的三维蛋白结构，即笼状结构。笼状蛋白可以具有对称结构，也可以具有非对称结构，笼状蛋白包含铁蛋白、小热休克蛋白(sHsp)、病毒衣壳蛋白或网格蛋白有被小泡等。
[0035]铁蛋白突变体：指在铁蛋白氨基酸序列的基础上，进行氨基酸氨基酸的置换、截短、延长本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包载药物的笼状蛋白的制备方法，包括以下步骤：步骤(a)：制备含有有机溶剂、药物和笼状蛋白的混合溶液；和步骤(b)：制备含有内腔包载药物的笼状蛋白的溶液；任选地，还包括步骤(c)：去除笼状蛋白笼外的游离药物和有机溶剂；优选地，步骤(a)采用混合或者溶液置换的方式；所述溶液置换采用如下一种或两种以上的工艺进行：工艺A：通过透析的方式将笼状蛋白的溶液笼外溶液置换成为含有有机溶剂的溶液；工艺B：通过离心过滤的方式；优选地，所述离心过滤选用超滤离心管离心过滤，进一步优选地，所述超滤离心管截留分子量为50-150KD，优选100KD；工艺C：通过凝胶过滤层析的方式；优选地，所述凝胶过滤层析的方式是使用Superdex 75pg凝胶柱过滤层析。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤(a)中所述有机溶剂选自二甲基亚砜、氯仿、甲醇和异丙醇中的一种或两种以上；优选地，所述有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇和/或氯仿；进一步优选地，所述有机溶剂选自二甲基亚砜。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤(a)中所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为5-30％，优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为5-25％，进一步优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-20％，进一步优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-15％，进一步优选地，所述混合溶液中有机溶剂的体积浓度为7-10％。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中，步骤(a)所述混合溶液含有水、Tris-HCl、HEPES-NaCl缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)缓冲液、丙烯酰胺缓冲液中的一种或两种以上；优选地，所述缓冲溶液选自Tris-HCl；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为10-100mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为25-75mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为40-75mmol/L；进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为45-55mmol/L，进一步优选地，所述Tris-HCl的浓度为50mmol/L。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其中，所述笼状蛋白选自铁蛋白、小热休克蛋白(sHsp)病毒衣壳蛋白或网格蛋白有被小泡；优选地，所述笼状蛋白选自铁蛋白；进一步优选地，所述铁蛋白含有L亚基和/或H亚基，进一步优选地，所述铁蛋白含有L亚基和H亚基的数量比为0-24:24-0，进一步优选数量比为9:1，24:0或0:24。6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述铁蛋白选自野生型铁蛋白、铁蛋白突变体、铁蛋白衍生物和/或重组铁蛋白；优选地，所述铁蛋白来源包括人、动物、植物和/或细菌；进一步优选地，人来源的铁蛋白选自人H型铁蛋白和/或人L型铁蛋白；动物来源的铁蛋白选自马脾铁蛋白；细菌来源的铁蛋白选自激烈火球菌铁蛋白。7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(a)所述混合溶液中笼状蛋白的浓度为1-20mg/mL；优选为2-8mg/mL，进一步优选为2-6mg/mL。8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其中，所述药物选自氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、塞替派、卡莫司汀、司莫司汀、白消安、顺铂、卡铂、草酸铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤、培美曲塞、5-FU、FT-207、卡培他滨、6-巯基嘌呤、6-TG、羟基脲、阿糖胞苷、吉西他滨、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、氯醌、心得安、戊烷脒、表阿霉素、癌霉素、盐酸
阿霉素、THP-阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素、道诺霉素、伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱、紫杉醇、多西他赛、长春花碱、去甲长春花碱、鬼臼碱类、高三尖杉酯碱、门冬酰胺酶、三苯氧胺、托瑞米芬、依西美坦、氨苯乙哌啶酮、福美司坦、来曲唑、阿那曲唑、甲孕酮、甲地孕酮、甲基睾丸酮、丙酸睾丸酮、己烯雌酚、阿托品、多巴胺、毛果芸香碱、蒽胺、苯海索、苯扎托品、丙环定、麦角碱类衍生物、氟它氨、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和贝伐珠单抗中的一种或两种以上；优选地，所述药物选自柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、盐酸阿霉素、THP-阿霉素、盐酸伊立替康、阿替洛尔、盐酸川穹嗪、马钱子...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯天一，劳芳，温佰刚，李彦良，李凡，欧阳芳幸，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：