本发明专利技术公开了一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置和制备方法，包括：具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件；分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置。本发明专利技术可实现具有超微量样品消耗的冷冻电镜样品制备实验，单个样品液滴的消耗量在纳升级及纳升级以下。样品消耗量较常规制样机器人减少了1000倍以上，显著降低了实验成本，缩短了蛋白质样品纯化周期。显著提高冷冻电镜制样的成功率和实验的重现性。的重现性。的重现性。
【技术实现步骤摘要】
一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法
[0001]本专利技术所涉及的领域为微流控、自动化和冷冻电镜领域，特别是涉及一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置及其制样方法。
技术介绍
[0002]冷冻电镜技术是当前生物大分子物质结构解析的主流技术，它通过拍摄镶嵌在铜网碳膜孔的无定型冰中的生物大分子颗粒照片，然后通过三维重构技术解析得到生物大分子的精细三维结构。用冷冻电镜技术解析蛋白质等生物大分子三维结构的主要流程包括：冷冻电镜样品制备、图像采集、数据处理和三维重构。冷冻电镜样品制备是冷冻电镜实验的第一步，其目的是将待分析的样品溶液铺展在铜网上，使样品溶液在铜网表面的碳膜上形成数十至数百纳米厚的液层，然后将铜网快速投入液态乙烷中冷冻，使样品由液态转变为冷冻电镜观测所需的玻璃态。除了生物样品本身的性质外，铜网碳膜孔中的无定型冰厚度是决定冷冻电镜能否采集到高清晰生物大分子颗粒的关键因素。此外对于一些珍贵的生物样品，其在制样实验中的样品消耗量也是必须要考虑的因素，样品消耗量越少意味着实验成本越低、实验效率越高。因此理想的冷冻电镜制样方法需要具备样品冰层厚度可控、样品消耗量小的特点。
[0003]冷冻电镜样品制备的常规方法为用商品化机器人进行制样。FEI公司的Vitrobot系统是当前主流的冷冻电镜制样机器人，被各大冷冻电镜中心广泛采用。但Vitrobot系统需人手工将4μL以上样品通过移液枪注射到固定在机器制样室中的铜网表面，然后Vitrobot系统制样室内的两片环形滤纸会被按压在铜网表面，吸走近99％的样品，以制备得到纳米级厚度的样品液层，最后仪器会将铜网插入液态乙烷中完成冷冻电镜样品制备实验。目前商品机器人用于冷冻电镜制样的主要缺点为样品消耗量较大(绝大部分样品被滤纸吸走)、铜网碳膜上的样品冰层厚度不可控、实验成功率低和重现性差。
[0004]除商品机器人外，也有少量文献报道了一些研究组自制的冷冻电镜制样装置，这些装置主要分为基于压电喷墨原理的冷冻电镜制样装置和基于气体喷射的微流控芯片。基于压电喷墨原理的冷冻电镜制样装置利用压电喷头将样品喷射到铜网表面，然后将铜网插入液态乙烷中快速冷冻完成制样。这类系统的局限性是其喷头的死体积较大(>30μL)，单次实验耗费的样品体积远超常规的制样机器人，样品液滴喷射在铜网的单一区域，对铜网的利用率不高，且仪器运行速度慢，铜网上的样品在插入液态乙烷的过程中容易变干。基于气体喷射的微流控芯片也已被应用到冷冻电镜制样中，其原理为在微流控芯片中加工微通道和喷嘴，将样品和高压气体(通常为氮气)持续通入芯片并在通道中混合，样品在高压气体的带动下从喷嘴出喷出，喷射在铜网表面，然后完成样品冷冻。微流控芯片用于冷冻电镜样品制备的主要缺点是连续喷射的样品流会消耗大量样品，体积在数十微升，对喷射到上的样品的体积可控性差，且高压气体会使铜网表面的碳膜破裂。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种具有纳升(10-9
升)及纳升以下样品消耗量，且样品冰层厚度可控的冷冻电镜样品制备装置。
[0006]为实现上述专利技术目的，可以采用如下技术方案：
[0007]一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置，包括：
[0008]具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件；
[0009]分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；
[0010]驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；
[0011]对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；
[0012]驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置。
[0013]本专利技术中，在制样操作状态，可以实现制样探针对待检测样品溶液在支持网组件上的制样；在冷冻操作状态，可以完成对支持网组件上待检测样品冷冻，进而实现最终冷冻样品的制作。通过快速转移装置实现支持网组件在两种工作状态的切换和转移。
[0014]本专利技术中，制样探针主要具有两个功能，一是完成样品溶液的取样，二是完成制样，第二个功能是其最核心的功能，通过制样探针可以实现对样品量和样品厚度的控制。
[0015]本专利技术中，所述支持网组件包括支持网以及设置在支撑网上的微孔膜，该微孔网上加工有微米级直径的多个微孔。
[0016]作为优选，还包括所述支撑网组件可进出的制样室，在该制样室内所述制样探针完成所述的制样操作；所述制样室壳体上设有避让制样探针或支持网组件的避让孔结构。
[0017]作为进一步优选，还包括对所述制样室进行恒温恒湿控制的控湿模块和控温模块。
[0018]作为优选，还包括对制样操作过程中支撑网组件上样品溶液状态以及制样位置或者制样量进行监控的监控模块。通过监控模块，可以实现更加方便的对制样液滴量和制样液滴厚度以及制样位置的控制，进一步增加了装置的可控性。
[0019]作为优选，所述制样探针为实心探针或者具有流道结构的毛细管结构；为实心探针结构时，制样探针取样端具有对待检测溶液具有亲和力的取样面或者取样微结构；为具有流道结构的毛细管结构时，还包括对所述毛细管结构提供取样动力的液体驱动装置。
[0020]作为优选，制样探针在制样操作时，输出的样品液滴的体积范围是10纳升至1纳升。
[0021]作为优选，制样探针对微量样品溶液的操纵体积范围为0.1飞升到10微升。
[0022]作为优选，对所述支持网组件用于承接样品溶液的一侧表面经过亲水性处理。通过上述表面处理，保证支持网组件用于承接样品溶液的一侧表面对待检测样品具有更好的亲和力。
[0023]一种利用上述任一项技术方案所述的装置制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，包括如下步骤：
[0024](1)制样探针进行取样操作，完成对待检测样品溶液的取样；
[0025](2)三维平移台驱动下，完成取样的制样探针转移至处于制样操作状态的支持网组件的对应位置；
[0026](3)制样探针对支持网组件上设定制样位置进行制样，在支持网组件表面的亲和力作用下得到具有不同液层厚度的梯度的样品液滴，完成待检测样品溶液在支持网组件上的制样操作；
[0027](4)快速转移装置驱动处于制样操作状态的支持网组件移动至冷冻模块，完成对支持网组件表面待检测样品的冷冻，制备得到用于冷冻电镜的微量样品。
[0028]下面对上述技术方案做进一步说明：
[0029]本专利技术的用于冷冻电镜的微量样品制备的装置由支持网组件、制样室模块、制样探针模块、冷冻模块、监控模块和系统控制模块构成；
[0030]所述的支持网组件由固定有微孔膜的支持网、支持网夹持装置和支持网快速移动装置组成。支持网起到支撑微孔膜的作用。微孔膜上加工有微米级直径的多个微孔，用于承载样品溶液所形成的样品液滴，微孔膜的厚度在纳米级。本专利技术的微孔膜可以采用碳膜。支持网由支持网夹持装置固定并安装在支持网快速移动装置上，支持网快速移动装置负责将支持网-微孔膜移至冷冻剂中完成快速冷冻。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，包括：具有制样操作状态和冷冻操作状态的支持网组件，该支持网组件表面对所述待检测样品溶液具有亲和性；分别进行取样操作以及在所述支撑网组件上对待检测样品溶液完成制样操作的制样探针；驱动制样探针在取样操作和制样操作之间转换的三维平移台；对支撑网组件上样品溶液进行冷冻操作的冷冻模块；驱动支持网组件在制样操作状态与冷冻操作状态之间进行转移的快速转移装置；还包括所述支撑网组件可进出的制样室，以及对所述制样室进行温度和湿度控制的控湿模块和控温模块。2.根据权利要求1所述的用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，还包括对制样操作过程中支撑网组件上样品溶液状态以及制样位置或者制样量进行监控的监控模块。3.根据权利要求1所述的用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，所述制样探针为实心探针或者具有流道结构的毛细管结构；为实心探针结构时，制样探针取样端具有对待检测溶液具有亲和力的取样面或者取样微结构；为具有流道结构的毛细管结构时，还包括对所述毛细管结构提供取样动力的液体驱动装置。4.根据权利要求1或4所述的用于冷冻电镜的微量样品制备装置，其特征在于，所述制样探针对微量样品溶液的操纵体积范围为0.1飞升到10微升。5.一种利用权利要求1～4任一项所述的装置制备用于冷冻电镜的微量样品的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制样探针进行取样操作，完成对待检测样品溶液的取样；(2)三维平移台驱动下，完成取样的制样探针转移至处于制样操作状态的支持网组件的对应位置；(3)制样探针对支持网组件上设定制样位置进行制样，在支持网组件表面的亲和力作用下得到具有不同液层厚...
【专利技术属性】
技术研发人员：方群，王建伟，叶升，张波，张小康，张兴，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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