本发明专利技术公开了一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器及其制备方法，涉及DNA纳米技术领域，该方法包括制备介孔二氧化硅，在介孔二氧化硅的孔内负载联吡啶钌，使用ssDNA封闭介孔二氧化硅的孔隙，得到ssDNA-Ru-MSNs；将ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA混合后修饰在电极上，得到寡核苷酸电化学发光传感器，ssDNA与Product DNA互为互补链。该电化学发光传感器包括电极，电极上修饰有ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA特异性结合物，ssDNA与Product DNA互为互补链。本发明专利技术能够对复杂样品进行超痕量检测，且不易受到外部环境干扰。且不易受到外部环境干扰。且不易受到外部环境干扰。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器及其制备方法
[0001]本专利技术涉及DNA纳米
，具体涉及一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器及其制备方法。
技术介绍
[0002]电化学发光(ECL)是通过电化学方法来触发化学发光的过程，ECL结合了电化学与化学发光的优点，具有高稳定性、高灵敏度、实验体系可控、检测范围宽、检测时间短等特点。ECL的原理是对反应物施加电压并在电极上进行电化学再生，生成的再生物自身或是与体系中的底物反应形成激发态物质，随后发生能量驰豫，激发态物质释放出一个光子到达基态，由激发态到基态产生的光辐射可以通过检测器进行检测。
[0003]ECL进行检测时常与生物传感器结合形成ECL传感器，ECL传感器不仅保留了化学发光(CL)传感器的优良灵敏度和宽动态浓度响应范围等优点，而且还拥有CL传感器不具有的优势：(1)可以通过控制电位来控制CL反应进程并提高其选择性；(2)电极附近光的产生为灵敏检测提供了改进的空间控制；(3)对目标分子进行电化学修饰，形成了具有CL活性的物质并扩大其分析应用。
[0004]虽然电化学发光传感器具有众多优势，但是在检测生物组织、唾液、体液等复杂样品时仍然存在以下问题：电化学发光信标物质的光效率低，容易受到环境(pH、温度等)的影响，难以实现对超痕量样品的检测。
技术实现思路
[0005]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器及其制备方法，能够对复杂样品进行超痕量检测，且不易受到外部环境干扰。
[0006]为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0007]一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S1、制备介孔二氧化硅，在介孔二氧化硅的孔内负载联吡啶钌，使用ssDNA封闭介孔二氧化硅的孔隙，得到ssDNA-Ru-MSNs；
[0009]S2、对待检测的寡核苷酸进行等温扩增，得到Product DNA，将ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA混合制备特异性结合物，将特异性结合物修饰在玻碳电极上，得到寡核苷酸电化学发光传感器，所述ssDNA与Product DNA互为互补链。
[0010]进一步的，对待检测的寡核苷酸进行等温扩增包括以下步骤：将模板DNA、待检测的寡核苷酸加入等温扩增缓冲液，再加入切割内切酶、聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸反应，得到Product DNA。
[0011]进一步的，所述ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA混合制备特异性结合物包括以下步骤：按体积比，将1份浓度为1uM～1fM的Product DNA与3～8份浓度为1mg/mL的ssDNA-Ru-MSNs混合，反应体系pH为6.6～8.2，温度为30～37℃，反应时间为6～24h。
[0012]进一步的，所述反应体系的pH为7.4，反应时间为12h。
[0013]进一步的，所述介孔二氧化硅的直径为93～104nm其表面孔隙的直径为3.5～4nm。
[0014]一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器，包括电极，所述电极上修饰有ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA特异性结合物，所述ssDNA与Product DNA互为互补链。
[0015]进一步的，所述电极为玻碳电极。
[0016]进一步的，所述电化学发光传感器还包括检测液，所述检测液包括浓度为0.01mol/L的TPA和浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS。
[0017]一种电化学发光传感器检测寡核苷酸的方法，包括以下步骤：将电极插入检测液中进行进行ECL测量。
[0018]进一步的，所述ECL测量的测量电压为0V～1.3V。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0020](1)本专利技术中用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器，介孔二氧化硅表面具有孔隙，能够便于负载信号分子Ru，通过ssDNA封闭孔口，避免Ru逃逸，同时，介孔二氧化硅具有较好的生物相容性以及稳定性，在使用时，能够较稳定且均匀的分散在检测系统中。通过等温扩增制备Product DNA，能够将待检测的寡核苷酸信号进行放大，Product DNA与ssDNA作用后形成双链结构并从介孔二氧化硅表面脱离，信号分子Ru被释放，产生ECL信号，本专利技术电化学发光传感器的检测范围为1.0
×
10-14
mol/L～1.0
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10-8
mol/L，检出限为1.885
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10-15
mol/L(S/N＝3：1)，且能够对复杂样品进行超痕量检测，不易受到外部环境干扰。
附图说明
[0021]图1为本专利技术实施例中DNA扩增技术用于狂犬病病毒寡核苷酸检测的示意图的结构示意图；
[0022]图2为本专利技术实施例中DNA-Ru-MSNs的表征图；
[0023]图3为本专利技术实施例中DNA-Ru-MSNs孔径的表征图；
[0024]图4为本专利技术实施例中DNA-Ru-MSNs的紫外-可见分光光度计以及傅里叶红外光谱仪对材料进行分析图；
[0025]图5为本专利技术实施例中12％聚丙烯酰胺凝胶法测定产物的分析电泳图；
[0026]图6为本专利技术实施例中ECL传感器的可行性分析图；
[0027]图7为本专利技术实施例中在Target DNA浓度为1.0
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10-10
mol/L时，Ru-MSNs/GCE的电化学循环伏安曲线图；
[0028]图8为本专利技术实施例中对pH、温度对ECL测量的影响图；
[0029]图9为本专利技术实施例中ECL检测的特异性、重现性以及稳定性分析图。
具体实施方式
[0030]以下结合附图对本专利技术的实施例作进一步详细说明。
[0031]参见图1所示，本专利技术实施例提供一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器的制备方法，包括：
[0032]S1、制备介孔二氧化硅，在介孔二氧化硅的孔内负载联吡啶钌，使用ssDNA封闭介孔二氧化硅的孔隙，得到ssDNA-Ru-MSNs，其中介孔二氧化硅的直径为93～104nm，其表面孔
隙的直径为3.5～4nm。
[0033]S2、制备Product DNA，将模板DNA、待检测的寡核苷酸加入等温扩增缓冲液，再加入切割内切酶、聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸反应，得到Product DNA。
[0034]S3、将ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA混合制备特异性结合物，将特异性结合物修饰在玻碳电极上，得到寡核苷酸电化学发光传感器，所述ssDNA与Product DNA互为互补链。
[0035]其中，ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA特异性结合物通过以下方法制备：按体积比，将1份浓度为1uM-1fM的Product DNA与3～8份浓度为1mg/mL的ssDNA-Ru-MSNs本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、制备介孔二氧化硅，在介孔二氧化硅的孔内负载联吡啶钌，使用ssDNA封闭介孔二氧化硅的孔隙，得到ssDNA-Ru-MSNs；S2、对待检测的寡核苷酸进行等温扩增，得到Product DNA，将ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA混合制备特异性结合物，将特异性结合物修饰在玻碳电极上，得到寡核苷酸电化学发光传感器，所述ssDNA与Product DNA互为互补链。2.如权利要求1所述的一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：对待检测的寡核苷酸进行等温扩增包括以下步骤：将模板DNA、待检测的寡核苷酸加入等温扩增缓冲液，再加入切割内切酶、聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸反应，得到Product DNA。3.如权利要求1所述的一种用于检测寡核苷酸的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：所述ssDNA-Ru-MSNs与Product DNA混合制备特异性结合物包括以下步骤：按体积比，将1份浓度为1uM～1fM的Product DNA与3～8份浓度为1mg/mL的ssDNA-Ru-MSNs混合，反应体系pH为6.6～8.2，温度为30～37℃，反应时间为6～24...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩鹤友，丁凡，王文静，李允，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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