本发明专利技术提供一种诊疗磁性细菌AMB-1-INPs及其制备方法，将纳米材料标记到趋磁细菌生物载体上，具体还涉及一种特异性强、快速简便的趋磁细菌的纳米荧光标记方法。本发明专利技术选择安全性高、靶向性强的趋磁细菌AMB-1作为细菌生物载体，将富含游离-SH的趋磁细菌AMB-1与负载ICG且表面带有马来酰亚胺基团的磷脂-聚合物纳米探针(INPs)进行化学交联，构建具有荧光成像能力的诊疗磁性细菌AMB-1-INPs。本发明专利技术的方法将纳米荧光探针INPs稳定地标记到趋磁细菌AMB-1表面，能够避免因交叉交联降低纳米探针与细菌表面反应的效率，所得诊疗磁性细菌AMB-1-INPs能够在外磁场的操控下深入穿透肿瘤进行荧光追踪，满足基础研究及临床上对实时评估肿瘤治疗效果的切实需求。肿瘤治疗效果的切实需求。肿瘤治疗效果的切实需求。
【技术实现步骤摘要】
一种诊疗磁性细菌及其制备方法
[0001]本专利技术涉及纳米医学领域，尤其涉及一种诊疗磁性细菌及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]在过去的几十年中，脂质体因为具有良好的生物相容性、低免疫原性、高灵活性、可控制释放动力学及可负载药物(如亲水性或疏水性药物、成像剂和化疗药等)。但是脂质体也存在不可避免的缺点，如药物动力学不足、局部靶向不强(非特异性生物分布)、缺乏深层组织穿透等也限制了其进一步应用在临床。近年来,细菌因其良好的肿瘤厌氧靶向能力及自主驱动的能力定向运动受到研究人员的关注，已经显示包括大肠杆菌、趋磁细菌和其他属菌优先通过厌氧趋化性在组织中积累，从而预示了基于细菌的治疗剂的潜在应用。虽然细菌可以用作治疗剂解决上述问题，但它们与基于计算机的肿瘤区域导航不兼容，计算机导航被认为是最有可能增强靶向性。然而，有研究表明趋磁细菌AMB-1的趋磁性可以结合计算机导航增强其靶向性，通过鞭毛和外部磁场控制的推进深入穿透肿瘤，使这一问题得到缓解。
[0003]趋磁细菌AMB-1是一种兼性微好氧型的微生物，能够在体内形成纳米磁性颗粒并能在外磁场的作用下做定向运动的细菌，其主要生存于水域中有氧-无氧过渡区中并且能够在水中及时有效地找到特定氧气浓度的区域，所以利用趋磁细菌AMB-1结合体外可操控磁场实现靶向递送至缺氧肿瘤深部成为当前研究的热点，如谢茂彬(“趋磁细菌AMB-1磁小体构建磁靶向抗癌药物投递系统”，2012年，华侨大学硕士学位论文)利用AMB-1中分离纯化的磁小体作为载体，通过京尼平将甲氨蝶呤连接到磁小体上构建了磁靶向抗癌药物投递系统，具有高载药量、高包封率、缓释及定向给药的优势。
[0004]现有技术中已有报道在细菌表面加入纳米材料为细菌提供保护层，以及纳米探针的制备芳芳，如CN200910188814公开了一种纳米颗粒及其制备方法，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)形成内核、磷脂形成的中间层环绕内核表面，含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇形成的外壳部分穿插于所述中间层。该文献不涉及荧光探针的标记，使用范围有限。CN201010607708公开了一种荧光纳米探针，也是以聚乳酸-羟基乙酸共聚物形成内核、磷脂形成的中间层环绕所述内核表面，含氨基或羧基的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)形成的外壳部分穿插于所述中间层，在其内核中分散有吲哚菁绿(ICG)，该荧光探针可对肿瘤细胞进行识别，但仅可用于肿瘤的早期诊断。上述两种现有技术中纳米颗粒的制备方法均采用的是搅拌混合的方式，制备效率较低，耗时较长。CN201210424026和CN201210574535也别公开了两种纳米药物颗粒及其制备方法，这两种方法结合了纳米包裹技术、化疗药物与用于热疗的近红外光热转换试剂三者的优点，两者所要解决的技术问题是热疗和化疗的联合作用，同时负载近红外光热转换试剂和化疗药物两种药物，并且缓释的技术问题。上述现有技术均没有采用减毒细菌进行肿瘤的靶向性治疗，更不涉及趋磁细菌AMB-1。
[0005]本专利技术的目的是开发一种新的药物递送策略，即细菌载体的方法，同时保持其对
实体肿瘤的深度靶向能力。将纳米荧光探针INPs高效、稳定地标记到趋磁细菌AMB-1表面，制备诊疗磁性细菌AMB-1-INPs，在外磁场的操控下深入穿透肿瘤进行荧光追踪，可实时评估其治疗的效果，为肿瘤发生发展及其临床治疗，以及相关抗肿瘤药物研究提供极大便利，有广阔的应用前景。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供了一种诊疗磁性细菌，所述诊疗磁性细菌的表面标记有纳米荧光探针(INPs)，所述INPs是通过表面的马来酰亚胺基团与经还原剂处理后的趋磁细菌表面的巯基化学交联；所述INPs包括两性化合物、单层脂类分子、近红外光热转换试剂和疏水性多聚物；所述两性化合物含有马来酰亚胺基团；所述细菌为趋磁细菌。
[0007]本专利技术还提供了一种特异性强、快速简便的纳米荧光探针标记诊疗磁性细菌的方法，所述方法包括将纳米荧光探针(INPs)表面的马来酰亚胺基团与经还原剂处理后的趋磁细菌表面的巯基化学交联，所述INPs包括亲水性外壳、中间层和疏水性内壳，所述亲水性外壳含有两性化合物，所述中间层含有单层脂类分子，所述疏水性内壳含有近红外光热转换试剂和疏水性多聚物；所述两性化合物穿插于所述中间层形成疏水性外壳；所述近红外光热转换试剂吸附在疏水性多聚物上，形成疏水性内壳。
[0008]优选地，所述两性化合物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-羧基聚乙二醇(DSPE-PEG)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰胺(DSPE-PEG-Mal)，优选为DSPE-PEG-Mal；优选地，所述单层脂类分子包括卵磷脂脂或脑磷脂，优选为植物卵磷脂，进一步优选为大豆卵磷脂。
[0009]优选地，所述外壳包括大豆卵磷脂和DSPE-PEG-Mal，两者质量比为2：3。
[0010]优选地，所述近红外光热转换试剂包括吲哚菁绿(ICG)、金纳米棒、碳纳米管中任一一种或多种，优选为ICG；优选地，所述疏水性多聚物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸、聚己内酯，优选为PLGA。
[0011]优选地，所述INPs还包括化疗药物，所述化疗药物吸附于两性化合物的脂端及单层脂类分子上；优选地，所述化疗药物包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、去甲长春花碱、铂类药物中任一一种或多种。
[0012]优选地，所述诊疗磁性细菌为趋磁细菌AMB-1菌株；优选地，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
[0013]本专利技术还提供了一种INPs的制备方法，包括如下步骤：
[0014](1)将大豆卵磷脂乙醇溶液和DSPE-PEG-Mal乙醇溶液以2：3的质量比混合，卵磷脂和DSPE-PEG-Mal总重量为PLGA总重量的15％；
[0015](2)ICG 4％乙醇溶液加入2mL4％乙醇溶液中；
[0016](3)将步骤(1)和(2)溶液混合，得到混合液，用超声破碎仪超声分散所述混合液5分钟；
[0017](4)在步骤(3)所述超声过程中，将PLGA丙酮溶液逐滴滴入所述混合溶液中，形成纳米探针分散液；
[0018](5)将步骤(4)所述纳米探针分散液转移到3500KDa的透析袋中透析浓缩，得到纯化的INPs。
[0019]本专利技术还提供了一种诊疗磁性细菌的制备方法，包括如下步骤：
[0020](1)按上述方法制备INPs；
[0021](2)将密度为10
7-108CFU/mL的趋磁细菌收集在离心管中，在3500rpm重力下离心；
[0022](3)将趋磁细菌重悬于20-30mM TCEP的PBS溶液中，在37℃下孵育20-120分钟；
[0023](4)用PBS洗涤细菌两次；
[0024](5)将1mL步骤(1)制备的INPs加入到步骤(4)所得的趋磁细菌中，在37℃下孵育20-120分钟；
[0025](6)离心洗涤，即得纳米荧光探针标记的诊疗磁性细菌。
[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种诊疗磁性细菌，所述诊疗磁性细菌的表面标记有纳米荧光探针(INPs)，所述INPs是通过表面的马来酰亚胺基团与经还原剂处理后的趋磁细菌表面的巯基化学交联；所述INPs包括两性化合物、单层脂类分子、近红外光热转换试剂和疏水性多聚物；所述两性化合物含有马来酰亚胺基团。2.一种纳米荧光探针标记趋磁细菌的方法，所述方法包括将纳米荧光探针(INPs)表面的马来酰亚胺基团与经还原剂处理后的趋磁细菌表面的巯基化学交联，所述INPs包括亲水性外壳、中间层和疏水性内壳，所述亲水性外壳含有两性化合物，所述两性化合物含有马来酰亚胺基团，所述中间层含有单层脂类分子，所述疏水性内壳含有近红外光热转换试剂和疏水性多聚物；所述两性化合物穿插于所述中间层形成疏水性外壳；所述近红外光热转换试剂吸附在疏水性多聚物上，形成疏水性内壳。3.根据权利要求1所述的诊疗磁性细菌或权利要求2所述的方法，所述两性化合物为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-羧基聚乙二醇(DSPE-PEG)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰胺(DSPE-PEG-Mal)，优选为DSPE-PEG-Mal；所述单层脂类分子包括卵磷脂脂或脑磷脂，优选为植物卵磷脂，进一步优选为大豆卵磷脂。4.根据权利要求1所述的诊疗磁性细菌或权利要求2所述的方法，所述近红外光热转换试剂包括吲哚菁绿(ICG)、金纳米棒、碳纳米管中任一一种或多种，优选为ICG；所述疏水性多聚物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸、聚己内酯，优选为PLGA。5.根据权利要求1所述的诊疗磁性细菌或权利要求2所述的方法，所述INPs还包括化疗药物，所述化疗药物吸附于所述两性化合物的脂端及单层脂类分子上，所述化疗药物包括阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、去甲长春花碱、铂类药物中任一一种或多种。6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林涛，邢婕华，尹婷，郑明彬，罗英梅，陈泽，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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