一种NK细胞的培养体系及培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种NK细胞的培养体系及培养方法。本发明专利技术提供的培养体系包括组分1和组分2；组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；组分2为NK细胞无血清培养基。利用本发明专利技术培养体系对NK细胞进行培养、扩增，14天可获得90％以上的效应细胞，扩增倍数约11000倍，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。治疗的广谱应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞的培养体系及培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞
，尤其涉及一种NK细胞的培养体系及培养方法。

技术介绍

[0002]NK细胞是目前已知的杀死发生肿瘤免疫编辑的肿瘤细胞的最主要的免疫细胞，是临床上进行肿瘤细胞免疫治疗的重要手段之一，临床研究表明，异体和自体的NK细胞免疫治疗是安全的。2009年卫生部就曾发布《自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术管理规范(征求意见稿)》，把NK细胞免疫治疗技术作为第三类医疗新技术列入了临床治疗的应用范围。但十年来，NK细胞治疗技术并没有在临床上得到广泛的应用，在前期的一些临床试验中，自体NK细胞疗法临床应用的疗效并不明显,其中根本原因是，无法得到足够数量和活性的NK免疫细胞影响了NK细胞的治疗效果，可以想象，在肿瘤负荷较大的患者，如果回输的NK细胞90％的以上处于沉默状态，而不是激活状态，那它对肿瘤细胞肯定不能有很好的杀伤作用，另外根据体外试验证明当NK细胞与肿瘤细胞在效靶比为10:1时，杀伤效率可达到80％以上，但是如果回输的NK细胞量远远小于体内的肿瘤细胞量，这个治疗效果就会减弱。因此，如何在体外实现NK细胞大规模扩增培养是目前NK细胞治疗的关键问题。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术提供一种NK细胞的培养体系及培养方法。本专利技术扩增体系可明显提高NK细胞的存活率和扩增倍数。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种NK细胞的培养体系，包括组分1和组分2；
[0006]所述组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；
[0007]所述组分2为NK细胞无血清培养基；
[0008]所所述组分1和组分2中，NK无血清培养基包括IL2、白蛋白和NK细胞基础培养基；
[0009]所述基因工程细胞为表达(Ⅰ)和(Ⅱ)所示蛋白的滋养细胞：
[0010](Ⅰ)CD4、CD8、CD137L中至少一种；
[0011](ⅠI)IL21和IL12的一种或两种。
[0012]一些实施方案中，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：
[0013]灭活的基因工程细胞
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1×
105～1
×
107cell cell/mL；
[0014]IL-2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
100～500U/mL；
[0015]白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1～9％v/v；
[0016]所述组分2包括NK细胞基础培养基和100～500U/mL IL-2、1～9％v/v白蛋白。
[0017]本专利技术提供的培养体系中，组分1在配制时，先不添加白蛋白和灭活的基因工程细胞，在培养细胞时再加入。组分2在配制时，先不添加白蛋白，在培养细胞时再加入。
[0018]一些具体实施例中，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：
[0019]灭活的基因工程细胞
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1×
106cell/mL；
[0020]IL-2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200U/mL；
[0021]白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5v/v％；
[0022]所述组分2包括NK细胞基础培养基和200U/mL IL-2、5％v/v白蛋白。
[0023]一些具体实施例中，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：
[0024]灭活的基因工程细胞
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1×
106cell/mL；
[0025]IL-2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200U/mL；
[0026]白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5v/v％；
[0027]所述组分2包括NK细胞基础培养基和200U/mL IL-2、1％v/v白蛋白。
[0028]一些实施方案中，所述IL-21为跨膜IL-21；所述IL-12由IL-12A和IL-12B组成，所述IL-12B为跨膜IL-12B。
[0029]一些具体实施例中，所述基因工程细胞为表达IL21、CD4和CD137L蛋白的滋养细胞。进一步的，滋养细胞为K562细胞，所述基因工程细胞为IL21-CD4-CD137L-K562。
[0030]一些实施方案中，所述NK细胞基础培养基为KBM581。
[0031]一些实施方案中，组分1和组分2中，所述NK细胞无血清培养基还包括抗生素。
[0032]其中，所述培养体系中抗生素的浓度为20～100U/ml。一些具体实施例中，抗生素的浓度为80U/ml。
[0033]一些具体实施例中，所述组分1包括KBM581培养基和：
[0034][0035]所述组分2包括KBM581培养基和200U/mL IL-2、5％v/v白蛋白、80U/mL庆大霉素。
[0036]一些实施方案中，所述抗生素选自庆大霉素、卡那霉素或青霉素中的至少一种。一些具体实施例中，所述抗生素为庆大霉素。
[0037]一些实施方案中，本专利技术还提供了本专利技术培养体系在扩增NK细胞中的应用。
[0038]本专利技术还提供了一种NK细胞的培养方法，包括：
[0039]步骤1：将PBMC细胞或NK细胞接种至本专利技术所述培养体系的组分1中，培养；
[0040]步骤2：将培养第3天的培养液离心，取细胞沉淀，加入本专利技术所述培养体系的组分2再培养；
[0041]步骤3：第4～6天向培养基中补加组分2；第7天补加基因工程细胞，定期补加组分2，培养第13～15天收集NK细胞。
[0042]一些实施方案中，所述NK细胞或PBMC细胞的接种密度为2
×
10
3-2
×
10
10
。一些具体实施例中，所述NK细胞或PBMC细胞的接种密度为2
×
107Cell/ml。
[0043]一些实施方案中，所述基因工程细胞与所述PBMC细胞的细胞数之比为1:1。
[0044]一些实施方案中，所述基因工程细胞与所述NK细胞的细胞数之比为1:1。
[0045]一些实施方案中，所述培养方法中的培养步骤均在37℃，5％CO2条件下进行。
[0046]本专利技术中，步骤3中，所述定期补加组分2具体为：
[0047]在第7天补加基因工程细胞后补充组分2至细胞浓度为1.0
×
105～1.0
×
107Cell/
ml。补加培养基后，当培养体系的体积大于300ml时转移至培养袋培养。
[0048]第8～11天补加组分2至细胞浓度为1.0
×
105～1.0
×
107Cell/ml，优选为1.0<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的培养体系，其特征在于，包括组分1和组分2；所述组分1包括NK细胞无血清培养基和灭活的基因工程细胞；所述组分2为NK细胞无血清培养基；所述组分1和组分2中，NK无血清培养基包括IL2、白蛋白和NK细胞基础培养基；所述基因工程细胞为表达(Ⅰ)和(Ⅱ)所示蛋白的滋养细胞：(Ⅰ)CD4、CD8、CD137L中至少一种；(ⅠI)IL21和IL12的一种或两种。2.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述组分1包括NK细胞基础培养基和：灭活的基因工程细胞
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ1×
105～1
×
107cell cell/mL；IL-2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
100～500U/mL；白蛋白
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1～9％v/v；所述组分2包括NK细胞基础培养基和100～500U/mL IL-2、1～9％v/v白蛋白。3.根据权利要求1所述的培养体系，其特征在于，所述IL-21为跨膜IL-21；所述IL-12由IL-12A和IL-12B组成，所述IL-12B为跨膜IL-12B。4.根据权利要求1～3任一项所述的培养体系，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞英豪，彭昉，王冶陶，
申请(专利权)人：杭州中赢生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：