本发明专利技术公开了一种基于功能化纳米探针的单细胞电化学传感器及其应用，属于电化学传感器和毒素检测技术领域。本发明专利技术所述的单细胞电化学传感器是利用纳米探针和电化学细胞传感器结合，使用普鲁士蓝对纳米探针进行功能化修饰，通过显微操作平台对单个细胞进行电流信号分析。本发明专利技术构建了一种可靠、操作简便、可重复性强的单细胞电化学检测平台，通过电化学计时电流法测定其电流值判断单个细胞受毒素刺激后的受损情况，从而快速、有效地评价真菌毒素细胞毒性，进一步使真菌毒素毒性在活细胞中实时监测和纳米环境检测中得到应用。时监测和纳米环境检测中得到应用。时监测和纳米环境检测中得到应用。
【技术实现步骤摘要】
一种基于功能化纳米探针的单细胞电化学传感器及其应用
[0001]本专利技术涉及一种基于功能化纳米探针的单细胞电化学传感器及其应用，属于电化学传感器和毒素检测
技术介绍
[0002]细胞传感器可用于定性或定量地检测未知有毒物质，并基于兴奋作用电位和细胞机制的特定特性确定这种物质的存在和含量，以检测和评估有害物质。在单个细胞水平上进行研究，可以获得反映细胞生理状态和过程更为准确、全面的信息，更好地了解细胞群体中某些特殊的细胞功能，更加深入的认识细胞间差异、细胞间相互作用信息和神经递质、药物刺激的生理影响等更深层次的信息。纳米电化学在生物化学、神经科学、催化、分子电子学、纳米科学(如纳米孔、纳米气泡和纳米颗粒)、聚合物科学、电沉积和可再生技术等广泛的跨学科研究中发挥着关键作用。纳米电极由于其体积小，可将穿透活细胞过程中的损伤降至最低，特别有利于对这些物种的细胞内测量。近年来，随着纳米电化学的发展，在溶液中进行化学测量具有纳米的空间分辨率、高的时间分辨率和超高的灵敏度和选择性。
[0003]T-2毒素是由镰刀菌属产生的一种真菌毒素，属于A类单端孢霉烯族毒素，也是毒性最强的一种。因为T-2毒素在自然界中分布极其广泛，在田间生长的作物如大麦、小麦、燕麦、黑麦和玉米等，以及库存的谷物中都可能有T-2毒素的存在，而且T-2毒素在-2～35℃之间都可以产生，产量会随着环境湿度的升高而增加。T-2毒素难以降解，普通的烹饪方式不会降低它的毒性，因此对人类和动物的健康都是一个严重威胁。1973年，世界粮食组织/卫生组织(JECFA)将T-2毒素认定为最危险的天然食品污染毒素之一，2017年中国发布了关于植物性饲料原料及猪、禽配合饲料国家标准，规定了T-2毒素在饲料中不能超过0.5mg/kg。T-2毒素能够引起动物体内和体外多种细胞中发生氧化应激反应。许多研究者也从氧化应激角度解释T-2毒素引起的多种毒性作用，如细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性、生殖毒性和神经毒性等。过氧化氢是细胞内活性氧(ROS)最具有代表性的自由基，细胞内活性氧过氧化氢水平与生物的生理、病理密切相关。然而，ROS的过度生成会压倒细胞自由基清除和修复系统，导致组织功能障碍和氧化应激。T-2毒素能够激活ROS依赖的线粒体凋亡通路，从而引起线粒体功能损伤。
[0004]目前毒性评价方法主要依赖于多细胞实验及动物实验，多细胞实验方法成本低、周期短、与机体具有一定同源性，但是多细胞培养灵敏度低，无法实现实时监测，动物毒理实验的结果虽能够真实全面系统地反映药物对机体的影响，但存在着成本高、周期长、重复性不够理想等缺点。
[0005]随着科技发展与进步，传统细胞和传感器技术相结合的多种新技术、新方法为毒性机制研究提供更多新的手段。细胞传感器的构建中，细胞作为感受器被固定到界面上，当受到外界药物刺激后会引起细胞生理活性改变，这些变化可被转化为光电信号，信号变化的大小可对细胞受到的药物刺激进行定性定量分析。目前专利(CN201610231154.0)提供了一种细胞检测石房蛤毒素的方法，检测线性范围1-10nM，即2.99-29.9ppb，检测限较高，灵
敏度较低，且该专利技术结合ELISA检测方法，并没有利用电化学传感方式。专利(CN201310511626.4)公开了一种基于石墨烯的单细胞传感方法，具体是将石墨烯转移到透明基底上，根据待测细胞大小选择合适的微流通道粘贴到石墨烯上，将光束聚焦照射到覆盖有微流通道的石墨烯位置，出射光分成s和p偏振分别照射到平衡探测器的两个探头，对电压信号进行采集，进行细胞信号分析处理，获得细胞的表征信息。但此方法只能区别单细胞形态，对药物检测还需进一步研究。
技术实现思路
[0006]为了解决上述至少一个问题，本专利技术提供了一种基于功能化纳米探针的单细胞电化学传感器及其在真菌毒素T-2毒素上的应用。本专利技术利用纳米探针和电化学细胞传感器结合，构建一种可靠、操作简便、可重复性强的肝癌单细胞体系，通过电化学计时电流法测定其电流值判断单个细胞受毒素刺激后的受损情况，从而快速、有效地评价真菌毒素细胞毒性。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种用于单细胞电化学传感的功能化纳米探针，所述功能化纳米探针的构建方法包括如下过程：将毛细管拉制成纳米显微针，在显微针针尖上沉积金纳米粒子制成纳米探针；然后将普鲁士蓝沉积在所得纳米探针上，获得功能化纳米探针。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述沉积金纳米粒子的过程是将显微针针尖浸泡在含氯金酸的硫酸溶液中，初始电位-0.25V，沉积15-20s。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述硫酸溶液中氯金酸的浓度为1mmol
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；硫酸的浓度为0.5mol
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。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，普鲁士蓝沉积的过程为：在含有0.1M HCl，2mM FeCl3，0.1M KCl和2mM K3[Fe(CN)6]的电镀液中电化学沉积；电位在0.2～-0.6V之间循环50个周期。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述功能化纳米探针的针尖半径为200-400nm。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述纳米探针的具体过程包括：初始拉制尖口开端为200nm；电镀金纳米粒子50-100nm，初始点位-0.25V，时间20s；探针尖端露出1-2cm金层作为电化学感应部分。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述功能化纳米探针的制备方法具体包括：
[0014](1)将玻璃毛细管采用拉针仪拉制出的纳米显微针，通过电沉积法在待表征的针尖上镀约金纳米粒子，在电极外层采用PDMS绝缘，用Apiezon蜡包裹纳米探针表面，尖端露出金层作为电化学感应部分；
[0015](2)通过电化学沉积普鲁士蓝对纳米探针进行进一步修饰，电位循环50个周期，用去离子水冲洗普鲁士蓝修饰的纳米探针，并在室温下干燥。
[0016]本专利技术的第二个目的是提供一种单细胞电化学传感器，所述单细胞电化学传感器的工作电极为上述的功能化纳米探针。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供一种单细胞毒性检测方法，所述方法是利用上述功能化纳米探针
[0018]将上述功能化纳米探针夹持在显微操作系统上进行自动化操控，直接刺入细胞进
行电化学检测。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述单细胞电化学传感器是对单个细胞进行直接电化学检测。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞为人肝癌细胞HepG2。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，所述检测方法是将功能化纳米探针定位于一个单独细胞的细胞上，且距离其他细胞至500μm。
[0022]本专利技术的第四个目的是提供一种利用上述的单细胞电化学传感器检测A类单端孢霉烯族T-2毒素毒性的方法，所述方法为：将毒素标准物质用MEM细胞培养液稀释成梯度浓度溶液，加入细胞培养皿中，5min后进行电化学检测，利用电化学计时电流法IT本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于单细胞电化学传感的功能化纳米探针，其特征在于，所述功能化纳米探针的构建方法包括如下过程：将毛细管拉制成纳米显微针，在显微针针尖上沉积金纳米粒子制成纳米探针；然后将普鲁士蓝沉积在所得纳米探针上，获得功能化纳米探针。2.根据权利要求1所述的功能化纳米探针，其特征在于，所述沉积金纳米粒子的过程包括：将显微针针尖浸泡在含氯金酸的硫酸溶液中，初始电位-0.25V，沉积15-20s。3.根据权利要求1所述的功能化纳米探针，其特征在于，所述硫酸溶液中氯金酸的浓度为1mmol
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；硫酸的浓度为0.5mol
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。4.根据权利要求1所述的功能化纳米探针，其特征在于，普鲁士蓝沉积的过程为：在含有0.1M HCl，2mM FeCl3，0.1M KCl和2mM K3[Fe(CN)6]的电镀液中电化学沉积；电位在0.2～-0.6V之间循环50个周期。5.根据权利要求1-4任一项所述的功能化纳米探针，其特征在于，所述功能化纳米探针的制备方法包括如下步骤：(1)将玻璃毛细管采用拉针仪拉制出的纳米显微针，通过电沉积法在待表征的针尖上镀约金纳米粒子，在电极外层采用PDMS绝缘，用Apiezon蜡包裹纳米探针表面，尖端露出金层作为电化学感应部分；(2...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，高璐，孙嘉笛，王利平，纪剑，张银志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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