一种多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒，所述试剂盒包括外显子反应液一、外显子反应液二、外显子反应液三、主反应混合液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。本发明专利技术的多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒，通过3个独立PCR反应分别对DMD基因第4、17、45外显子，8、50、52外显子，47、48、51外显子进行扩增，3种反应液均包含4个荧光通道，从而实现对DMD基因的4、8、17、45、47、48、50、51、52外显子拷贝数的定量检测。52外显子拷贝数的定量检测。52外显子拷贝数的定量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体来说，涉及一种多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的相对定量方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]杜氏/贝氏肌营养不良症(Duchenne/Beckman muscμLar dystrophy；DMD/BMD)是DMD基因变异导致dystrophin蛋白缺陷所引起的一种X连锁隐性遗传的、以进行性肌无力和肌肉萎缩为特点的遗传性肌肉病变。其临床特征包括：肌痉挛、肌痛、股四头肌肌病、无症状高肌酸激酶血症、X-连锁扩张型心肌病等。
[0003]女性DMD基因缺陷携带者临床表现差异较大，重者可为典型DMD表现，轻者表现为轻度近端肌无力、腓肠肌假性肥大，也可表现为肌肉功能基本正常。DMD在男婴中的发病率约为1/3500-1/4000，多于5-6岁起病，表现走路慢，易摔倒，走路姿势异常，多数在13周岁之前丧失独立行走能力，20-30岁死于心肺功能衰竭。BMD在男性中发病率约为1/8000-1/10000，临床症状出现较DMD晚，可保持行走能力到16岁，病情进展相对缓慢，寿命较长，寿命可达40-50岁。儿童期或青年期BMD患者可表现为肌肉痛性痉挛肌痛或无症状高肌酶血症。本病目前尚无具有普适性有效治疗方案。
[0004]杜氏/贝氏肌营养不良症的致病原因为DMD基因缺陷。DMD基因是至今已发现的最大的基因，定位于Xp21.2，包含79个外显子，7种组织特异性启动子，2200000个碱基对。DMD基因所编码的Dystrophin蛋白分子量426kD，由3685个氨基酸组成，分为4个区域：1.与细胞内肌动蛋白(F-actin)相互作用的氨基端区(14-240氨基酸)：包括第1-8个外显子；2.由24个三聚螺旋状重复结构组成的中央棒状区(253-3040氨基酸)：包括9-63号外显子，与α肌动蛋白(α-actin)和血影蛋白同源；3.与肌膜上糖蛋白复合体相互作用的富含半胱氨酸区域(3080-3360氨基酸)：包括64-68外显子；4.与细胞内的syntrophins蛋白相互作用的羧基端区域(3361-3685氨基酸)：包括68-79号外显子。
[0005]DMD基因编码的Dystrophin蛋白具有连接细胞骨架与基底膜的功能，并与其他蛋白(dystroglycan、sarcoglycan)形成dystrophin蛋白复合体以维持细胞膜稳定性。DMD基因的变异可破坏其mRNA开放读码框，严重影响dystrophin蛋白合成和功能，导致dystrophin蛋白复合体破坏，使肌细胞膜脆性增加、稳定性降低，强烈的肌肉收缩加剧肌细胞膜破裂，并使钙离子内流加速肌纤维的破坏，从而导致杜氏/贝氏肌营养不良症的临床表现。
[0006]目前杜氏/贝氏肌营养不良症的临床治疗主要以保存患者运动功能、防治并发症为治疗目的，包括：糖皮质激素治疗、适当康复锻炼及外科矫形等。虽然在基因编辑、外显子跨越、PTC蛋白修复等治疗策略上取得重要进展，但目前尚无有效的根治方法，遗传阻断仍是最好的应对策略。杜氏/贝氏肌营养不良症的临床表现具有明显异质性的特点。
[0007]DMD基因变异多样，主要包含4类。1：外显子拷贝数变异(CNV)，包括外显子缺失
(deletion)和外显子重复(duplication)。2：外显子的点突变(substitution)；3：外显子的小插入和小缺失(indels)；4：未知变异(unknown)：主要是影响剪接的内含子突变。根据DMD专业数据库LOVD收录的DMD基因变异案例，上述各类变异的频率统计如表1所示：
[0008]表1.DMD基因变异类型及相应比例
[0009]变异类型DeletionDuplicationSubstitutionIndelsUnknown在所有变异中的比例56％11％31％0.7％1.3％在致病性变异中的比例66％12％20％0.9％1.1％
[0010]从上述的DMD基因变异类型及相应比例中可以得出结论，在DMD基因的致病性变异中，片段缺失或重复变异，占比达到78％左右，是导致杜氏/贝氏肌营养不良症的主要变异类型。
[0011]目前临床上DMD基因的拷贝数检测多使用荷兰MRC公司生产的多重连接探针扩增(Multiple Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)检测技术，DMD的MLPA检测试剂盒设计了P034探针组和P035探针组，其中P034探针组包括了用于检测DMD 40个外显子的40对探针和9个内参基因的9对探针；P035探针组包括了用于检测DMD 40个外显子的40对探针和8个内参基因的8对探针。每对探针与样本DNA杂交后，探针对中的两条探针首尾相连，在连接酶的作用下，可以连接成一条完整的DNA模板。P034的49对探针及P035的48对探针在完成连接后，使用通用引物进行PCR扩增，每个探针对连接产物扩增产生的PCR片段大小各不相同(每对探针中的两条探针5
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端或3
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端带有通用引物序列。使用填充序列使得PCR产物大小不一，产物大小为预先设定)，然后使用毛细管电泳进行片段筛选区分各个大小不同的PCR产物，根据PCR产物的长度(bp数)，判断扩增产物片段所代表的DMD外显子编号，根据DMD外显子PCR产物与内参基因PCR产物的丰度比率，判断DMD基因各外显子是否发生缺失或重复。
[0012]DMD基因的MLPA检测技术具有良好的准确性，但是，MLPA检测技术试剂成本较高，片段筛选使用的毛细管电泳设备，如ABI 3130或3500等，价格昂贵。另外，MLPA检测技术流程中环节较多，主要包括杂交过夜、探针连接、PCR扩增、片段筛选四个主要步骤，较多的环节对操作人员的实验技能及熟练程度提出了较高的要求，也增加了RQ值出现较大波动、样本编号出错的可能性。此外，DMD基因的拷贝数检测最有价值的应用是女性携带者筛查，这样，就需要进行大样本量检测，MLPA检测技术由于其技术环节较多，在应对大样本量的检测时具有一定的实际操作困难性。
[0013]鉴于DMD基因的MLPA检测技术的上述问题，本专利技术使用多重荧光定量PCR技术，对DMD基因的外显子缺失或重复进行定量检测。荧光定量PCR技术使用实时扩增中的
△△
Ct法进行拷贝数定量，较MLPA技术的片段扩增丰度相对比率定量具有更好的准确性；另外,所需主要设备仅为荧光实时PCR仪，设备价格远低于MLPA技术所使用的片段筛选设备如ABI3130或3500等，便于检验机构或医院配置使用；此外，荧光定量PCR检测技术操作非常简单，实验者仅需在96孔板中加入样本DNA和反应混合液，即可上机运行并完成检测，因此，对实验者操作技能要求不高；易于获得稳定的检测结果；易于实现大样本筛选操作；且试剂成本低廉。
[0014]尽管多重荧光定量PCR技术具有上述优势，但是，DMD基因的427m转录本具有79个外显子，如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，包括外显子反应液一、外显子反应液二、外显子反应液三、主反应混合液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品；所述外显子反应液一为含有针对DMD基因第4、17、45外显子的特异性引物及探针和针对CFTR基因的特异性引物及探针的溶液；所述外显子反应液二为含有针对DMD基因第8、50、52外显子的特异性引物及探针和针对CFTR基因的特异性引物及探针的溶液；所述外显子反应液三为含有针对DMD基因第47、48、51外显子的特异性引物及探针和针对CFTR基因的特异性引物及探针的溶液；所述主反应混合液包含PCR反应缓冲液、dNTPs、Mg
2+
、热启动Taq酶、UNG酶、ROX荧光参比染料；所述阴性对照品为含CFTR基因序列的质粒DNA溶液；所述阳性对照品为含CFTR基因序列及DMD基因序列的质粒DNA溶液；所述空白对照品为经过除菌处理的去离子水。2.根据权利要求1所述的多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述外显子反应液一、外显子反应液二、外显子反应液三的装量均为500μL，所述主反应混合液的装量为1mL，所述阴性对照品的装量为15μL，所述阳性对照品的装量为30μL，所述空白对照品的装量为1mL。3.根据权利要求1所述的多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述外显子反应液一中DMD基因第4、17、45外显子的特异性引物及探针序列为：第4外显子的上游引物序列：5
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AAGGCACTGCGGGTTTTG
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，如SEQ ID NO.1所示，第4外显子的下游引物序列：5
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GTCACAGCATCCAGACCTTGTC
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，如SEQ ID NO.2所示，第4外显子的探针序列：5
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FAM
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AGAACAATAATGTAAGTAGTACCC
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MGB-NFQ，如SEQ ID NO.3所示，第17外显子的上游引物序列：5
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TGACCTCTGTTTCAATACTTCTCACA
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，如SEQ ID NO.4所示，第17外显子的下游引物序列：5
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GTCACCGTAGTTACTGTTTCCATTACA
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，如SEQ ID NO.5所示，第17外显子的探针序列：5
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ABY-ACCACCACTCAGCCATCACTAACACAGACA-3
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QSY，如SEQ ID NO.6所示，第45外显子的上游引物序列：5
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TCTTCCCCAGTTGCATTCAAT
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，如SEQ ID NO.7所示，第45外显子的下游引物序列：5
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CAGGAACTCCAGGATGGCATT
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，如SEQ ID NO.8所示，第45外显子的探针序列：5
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VIC-TTCTGACAACAGTTTGCCGCTGCC
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QSY，如SEQ ID NO.9所示；所述外显子反应液一中CFTR1基因的特异性引物及探针序列为：上游引物序列：5
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TTGTGCCTGTTGCAGCTTCT
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，如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列：5
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TGGAGTTACAGAAAGGCCTCATG
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，如SEQ ID NO.11所示，探针序列：5
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Cy5-CGAATGGCACCACCTTCTCGGTGT
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QSY，如SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求3所述的多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述外显子反应液一中DMD基因第4、17、45外显子特异性上游引物、下游引物浓度均为100~800nmol/L，第4、17、45外显子特异性探针浓度为50~300nmol/L；所述外显子反应液一中CFTR1基因的上游引物、下游引物浓度均为100~800nmol/L，CFTR1基因的探针浓度为50~300nmol/L。5.根据权利要求1所述的多重实时荧光PCR法检测人DMD基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述外显子反应液二中DMD基因第8、50、52外显子的特异性引物及探针序列为：第8外显子的上游引物序列：5
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TGTACATCACATCACTCTTCCAAGTTT
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，如SEQ ID NO.13所示，第8外显子的下游引物序列：5
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CCTTGGCAACATTTCCACTTC
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，如SEQ ID NO.14所示，第8外显子的探针序列：5
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FAM-CTCAACAAGTGAGCATTGAAGCCATCCA
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QSY，如SEQ ID NO.15所示，第50外显子的上游引物序列：5
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GCTGGCTGGATCAGGAATACA
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，如SEQ ID NO.16所示，第50外显子的下游引物序列：5
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CGCAGGAGCCCTACATCTG
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，如SEQ ID NO.17所示，第50外显子的探针序列：5
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ABY-AGGCCCACTGCCTGCAATTCAGG
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QSY，如SEQ ID NO.18所示，第52外显子的上游引物序列：5
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GCGGTAATGAGTTCTTCCAACTG
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【专利技术属性】
技术研发人员：于超计，王倩玉，赵立明，
申请(专利权)人：北京华瑞康源生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：