一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法，具体是将待测细胞和对照角膜基质细胞的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，检测NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因的表达水平，通过将对照角膜基质细胞的各基因表达量定为1，计算待测细胞中各基因的相对表达量RQ，从而判断待测细胞是否为人角膜内皮细胞。本发明专利技术通过NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2四种标志基因组合可对体外培养HCECs进行角膜基质细胞污染及HCECs成纤维细胞转化程度进行鉴定，指导体外HCECs培养工艺参数的优化及对制备最终HCECs产品进行鉴定，保证体外培养HCECs具有CEC细胞特定功能。保证体外培养HCECs具有CEC细胞特定功能。保证体外培养HCECs具有CEC细胞特定功能。

【技术实现步骤摘要】
一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法。

技术介绍

[0002]人角膜由三个细胞层组成，即上皮细胞、基质细胞和内皮细胞。其中内皮细胞是4μm厚的单层细胞，位于角膜内侧，人角膜内皮通过泵和漏屏障功能的组合调节房水流向角膜基质，从而保持角膜透明度。当人角膜内皮细胞(HCECs)的增殖能力受到严重限制，对角膜内皮的严重损害导致角膜内皮功能障碍，并最终导致角膜透明度的丧失。目前，角膜移植是治疗角膜内皮功能障碍的唯一治疗选择，培养的HCECs已被认为是供体角膜的替代组织来源，但细胞培养的技术障碍来自于HCECs容易受到基质角膜细胞和成纤维细胞转化污染，也称为内皮-间质转化，进而引起细胞功能的改变。因此，开发有效鉴定人角膜内皮细胞的方法很有必要。

技术实现思路

[0003]针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法。
[0004]专利技术人通过对分离培养的HCECs与角膜基质细胞进行基因转录组高通量测序分析，筛选得到与基质细胞有显著性差异、且与角膜功能相关的8种基因(ACTA2、CDH2、ALCAM、TGFB1I1、COL9A2、LTBP2、PCP4、NCAM1)，同时对制备得到的多批次HCECs进行质量研究，通过体外生物学评价方法并结合动物实验对HCEC
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进行有效性评价，最终确定HCECs生物学特性及动物实验有效性相关的四种标志基因(NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2)，可用于指导体外HCECs培养工艺参数的优化及对制备的最终HCECs细胞产品进行鉴定。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法，包括以下步骤：
[0007]步骤1，提取待测细胞和角膜基质细胞的总RNA并将其反转录为cDNA；
[0008]步骤2，以步骤1中得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，检测NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因的表达水平；
[0009]步骤3，根据步骤2的检测结果，将角膜基质细胞的各基因表达量定为1，计算待测细胞中各基因的相对表达量RQ，如果log(RQ)同时满足NCAM1≥0.6、ALCAM≥1.0、CDH2≥2.0、ACTA2≤-1.0，则说明待测细胞为人角膜内皮细胞；
[0010]步骤2中所采用的扩增引物如下：
[0011]NCAM1：上游引物cctcccaccaaccatcatct，下游引物tttcttgatgccccggatct，
[0012]ALCAM：上游引物ctgcaggaggttgaaggact，下游引物ggctggctttggaaaacctt，
[0013]CDH2：上游引物ccatcattgccatcctgctc，下游引物gtttggcctggcgttcttta，
[0014]ACTA2：上游引物aagatcctgactgagcgtgg，下游引物ttctccttgatgtcccggac。
[0015]有益效果：本专利技术通过NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2四种标志基因组合可对体外培养HCECs进行角膜基质细胞污染及HCECs成纤维细胞转化程度进行鉴定，指导体外HCECs培养
工艺参数的优化及对制备最终HCECs产品进行鉴定，保证体外培养HCECs具有CEC细胞特定功能。
附图说明
[0016]图1为本专利技术中差异基因分析图。
[0017]图2为本专利技术中CD56(NCAM1)、CD166(ALCAM)两种基因表达的蛋白在角膜组织切片的免疫荧光检测结果。
[0018]图3为实施例1中的细胞形态图。
具体实施方式
[0019]专利技术人通过对分离培养的HCECs与角膜基质细胞进行基因转录组高通量测序分析，筛选得到与基质细胞有显著性差异、且与角膜功能相关的8种基因(ACTA2、CDH2、ALCAM、TGFB1I1、COL9A2、LTBP2、PCP4、NCAM1)，同时对制备得到的多批次HCECs进行质量研究，通过体外生物学评价方法并结合动物实验对HCEC
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进行有效性评价，最终确定HCECs细胞生物学特性及动物实验有效性相关的四种标志基因(NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2)，可用于指导体外HCECs培养工艺参数的优化及对制备的最终HCECs产品进行鉴定。具体过程如下：
[0020]步骤1，首先对专利技术人在前期分离培养的HCECs与角膜基质细胞进行基因转录组高通量测序，筛选出差异基因、同时对差异基因进行富集分析，富集分析结果见图1，筛选得到与基质细胞有显著性差异，同时与角膜功能相关的8种基因，基因列表见表1。
[0021]表1转录组测序分析筛选标志基因列表
[0022]geneNameCategoryDescriptionCountUpDownACTA2BPmuscle contraction1067333CDH2BPblood vessel morphogenesis17810771ALCAMBPchemotaxis1437964TGFB1I1BPregulation of cellular response to growth factor stimulus824636COL9A2BPskeletal system development1095554LTBP2CCextracellular matrix18910287PCP4BPpositive regulation of nervous system development1405783NCAM1BPchemotaxis1437964
[0023]步骤2，对专利技术人前期制备的7批次HCECs、1批次角膜基质细胞、1批次角膜间质化细胞进行标志基因检测，检测结果见表2，对HCECs基因表达量对分析，NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因组合能较好区分角膜基质细胞、角膜间质化细胞。
[0024]表2 HCEC细胞、角膜基质细胞、角膜间质化细胞标志基因检测
[0025][0026]步骤3，对步骤2中的样本同时进行细胞表型检测，NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因表达量与HCECs、角膜基质细胞、角膜间质化细胞具有表型相关性，与对照角膜基质细胞的基因表达量对比，统计7批次HCECs NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因相对表达量(RQ)，将7批次log(RQ)求均值后-SD作为HCECs质量标准，即NCAM1≥0.6、ALCAM≥1.0、CDH2≥2.0、ACTA2≤-1.0。结果见表3。
[0027]表3 NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因表达量
[0028][0029]通过以上结果，最终确定HCECs生物学特性及动物实验有效性相关的四种标志基因(NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2)，可用于指导体外HCECs培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人类角膜内皮细胞的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，提取待测细胞和对照角膜基质细胞的总RNA并将其反转录为cDNA；步骤2，以步骤1中得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，检测NCAM1、ALCAM、CDH2、ACTA2基因的表达水平；步骤3，根据步骤2的检测结果，将角膜基质细胞的各基因表达量定为1，计算待测细胞中各基因的相对表达量RQ，如果log（RQ）同时满足NCAM1 ≥ 0.6、ALCAM ≥1.0 、CDH2 ≥2.0、ACTA2 ≤
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1.0，则...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘辉，戴舒春，方攀峰，张俊克，王云娟，
申请(专利权)人：江苏艾尔康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：