一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法及试剂盒技术

本申请提供一种精准定量的ATAC

【技术实现步骤摘要】
一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]目前我们可以通过转座酶可及染色体(ATAC)测定，来研究基因组中开放染色质区域，开放染色质区域是转录因子与转录元件的重要结合位点。目前用于研究开放染色质区域的方法有：1.DNase-seq，将裸露的DNA片段用DnaseI内切酶切割，对切割完的DNA片段进行测序，与已知的全基因组序列进行比对，就能发现被切割掉的区域是哪部分，可以找到开发染色质区域，但是该方法操作繁琐、时间长(2-3天)，需要大量的细胞核用于实验(一百万以上个细胞核)，并且重复性也较差。2.ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing运用测序手段研究转座酶可接近的染色质的实验)，利用Tn5转座酶直接处理细胞核，该方法操作简单、几个小时就能完成，需要的细胞核的量少，只需要500个细胞核即可完成建库测序，也能够更好的保证重复性，因此得到广泛的应用。
[0003]目前市场上用于ATAC高通量文库制备的主流试剂盒有Illumina公司Nextera系列等。这些试剂盒能满足不同的植物样品来源，最大程度的满足了科研应用，但是，目前市场上还没有一种完成精准定量的文库制备的方法，常规的ATAC-seq文库中的建库方法实验过程中仍然存在系统性误差，尤其在针对少量样品时，需要增加测序量来提高检测的准确性，而这种情况下数据的重复率会大幅增加，限制了该方法应用于精准医学和疾病预测的等其他需要。因此，需要建立一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法及试剂盒。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于，提供一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法及试剂盒，实现精准定量。
[0005]本申请的第一方面，涉及一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法，所述方法包括：
[0006](a)提供两种衔接子，第一衔接子为5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二衔接子为5`-S5-S6-S7-S8-3`，其中,所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为1-95的任一整数，S3为固定序列，所述S4与S8的碱基序列相同，为Tn5转座子固定序列，S5为第二测序引物，S6为随机标签序列，S6的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S6的碱基的数量为1-100的任一整数，S7为固定序列；将所述两种衔接子与Tn5酶进行孵育得到转座复合体；
[0007](b)再将转座复合体与测试样本进行孵育，得到扩增模板；
[0008](c)将所述扩增模板进行PCR扩增，得到测序文库。
[0009]在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述S1为
[0010]5`-TGTGAGAAATCTAGCATACGACTTCGTC-3`(SEQ ID NO:1),S3为
[0011]5`-GCGATCGC-3`,S4和S8的碱基序列为5`-AGATGTGTATAAGAGACAG-3`(SEQ ID NO:
2),S5为5`-CTGACTCCACACTGTAGAAGCCATGACACGG-3`(SEQ ID NO:3),S7为5`-CACCGTGCTC-3`(SEQ ID NO:4)，S2的碱基的数量为10-50的任一整数。
[0012]进一步的，S2的碱基的数量为15-30的任一整数。
[0013]进一步的，两种衔接子与Tn5酶混合前，分别将单链的第一衔接子与第二衔接子与单链M退火杂交形成双链衔接子，单链M的序列为5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3(SEQ ID NO:5)。
[0014]进一步的，将Tn5酶与合成的双链衔接子按照1∶1的摩尔比进行混合，然后进行孵育，得到转座复合体。
[0015]在一些实施方式中，在步骤(b)中，转座复合体与测试样本进行孵育，得到含“衔接子-核酸-衔接子”复合物的混合物，将该混合物进行纯化，得到扩增模板。
[0016]进一步的，测试样本为植物或动物的细胞核，用细胞裂解液处理细胞，得到完整的细胞核。
[0017]进一步的，测试样本的细胞核的数量为500-10000个。
[0018]进一步的，用台盼蓝染色观察并计数细胞核的数量。
[0019]进一步的，将所述混合物用MiniElute PCR纯化试剂盒进行纯化。
[0020]在一些实施方式中，在步骤(c)中，将扩增模板用能够特异性结合于第一衔接子的第一引物Primer1和特异性结合与第二衔接子的第二引物Primer2进行PCR反应，获得扩增产物。
[0021]进一步的，Primer1的结构为P1-I1-P2，其中P1为：5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3`(SEQ ID NO:6)，I1为测序标签序列(index序列)，P2为:5`-ACACTCTTTAGATCGTATGCTGAAGCAG-3`(SEQ ID NO:7)，Primer2的结构为P3-I2-P4，其中P3为5`-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3`(SEQ ID NO:8)，I2为测序标签序列(index序列)，P4为5`-GACTGAGGTGTGACATCTTCGGTACTGTGCC-3`(SEQ ID NO:9)。
[0022]进一步的，所述I1选自：CTCTCTAT，TATCCTCT，AGAGTAGA，GTAAGGAG，ACTGCATA，AAGGAGTA，CTAAGCCT中的一种，所述I2选自：GCATGATC，TCCGTCTT，AGGACTCG，CCTGAGGA，ATCCGTAC，GAGAGATG，GTCTCTCC中的一种。
[0023]进一步的，扩增产物需要进行纯化，然后得到测序文库。
[0024]进一步的，扩增产物采用MiniElute PCR纯化试剂盒纯化，纯化产物就是测序文库。
[0025]进一步的，测序文库进行片段长度范围检测和浓度定量后即可进行二代测序及数据分析。
[0026]进一步的，通过Agilent 2100Bioanalyzer进行片段长度范围检测，通过Invitrogen Qubit进行浓度定量，二代测序为采用Illumina高通量测序平台。
[0027]本申请的第二方面，涉及一种精准定量的ATAC-seq文库制备试剂盒，所述试剂盒包括：第一衔接子和第二衔接子，第一衔接子为5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二衔接子为5`-S5-S6-S7-S8-3`，所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为1-95的任一整数，S3为一固定序列，所述S4与S8的碱基序列相同，为Tn5转座子固定序列，S5为第二测序引物，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，所述方法包括：(a)提供两种衔接子，第一衔接子为5`-S1-S2-S3-S4-3`，第二衔接子为5`-S5-S6-S7-S8-3`，其中,所述S1为第一测序引物，S2为随机标签序列，S2的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S2的碱基的数量为1-95的任一整数，S3为固定序列，所述S4与S8的碱基序列相同，为Tn5转座子固定序列，S5为第二测序引物，S6为随机标签序列，S6的碱基为A、T、G、C中的一种或多种的随机组合，S6的碱基的数量为1-100的任一整数，S7为固定序列；将所述两种衔接子与Tn5酶进行孵育得到转座复合体；(b)再将转座复合体与测试样本进行孵育，得到扩增模板；(c)将所述扩增模板进行PCR扩增，得到测序文库。2.如权利要求1所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，所述方法包括选自下组的一个或多个特征：(1)在步骤(a)中，所述S1为5`-TGTGAGAAATCTAGCATACGACTTCGTC-3`,S3为5`-GCGATCGC-3`,S4和S8的碱基序列为5`-AGATGTGTATAAGAGACAG-3`,S5为5`-CTGACTCCACACTGTAGAAGCCATGACACGG-3`,S7为5`-CACCGTGCTC-3`，S2碱基的数量为10-50的任一整数，优选的，S2碱基的数量为15-30的任一整数；(2)在步骤(a)中，两种衔接子与Tn5酶混合前，将单链的第一衔接子和第二衔接子与单链M退火杂交形成双链衔接子，单链M的序列为5'-CTGTCTCTTATACACATCT-3；将Tn5酶与合成的双链衔接子按照1：1的摩尔比进行混合，然后进行孵育，得到转座复合体；(3)在步骤(b)中，转座复合体与测试样本进行孵育，得到含“衔接子-核酸-衔接子”复合物的混合物，将该混合物进行纯化，得到扩增模板；优选的，测试样本为植物或动物的细胞核，测试样本的细胞核的数量为500-10000个；(4)在步骤(c)中，将扩增模板用能够特异性结合于第一衔接子的第一引物Primer1和特异性结合与第二衔接子的第二引物Primer2进行PCR反应，获得扩增产物，其中，Primer1的结构为P1-I1-P2，P1为：5`-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3`，I1为测序标签序列，P2为:5`-ACACTCTTTAGATCGTATGCTGAAGCAG-3`，Primer2的结构为P3-I2-P4，其中P3为5`-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3`，I2为测序标签序列，P4为5`-GACTGAGGTGTGACATCTTCGGTACTGTGCC-3`；优选的，所述I1选自：CTCTCTAT，TATCCTCT，AGAGTAGA，GTAAGGAG，ACTGCATA，AAGGAGTA，CTAAGCCT中的一种，所述I2选自：GCATGATC，TCCGTCTT，AGGACTCG，CCTGAGGA，ATCCGTAC，GAGAGATG，GTCTCTCC中的一种。3.如权利要求1-2任一所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，扩增产物需要进行纯化，然后得到测序文库。4.如权利要求1所述的精准定量的ATAC-seq文库制备方法，其特征在于，所述测序文库进行片段长度范围检测和浓度定量后即可进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华，俞振勋，弓晋欣，胥政昊，
申请(专利权)人：苏州京脉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：