云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用技术

本发明专利技术公开了云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用，该云锦杜鹃花TPS基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术首次从云锦杜鹃花中克隆得到杜鹃花萜烯合酶基因RhTPS，该基因为杜鹃花花香形成的关键基因之一，可以通过转基因等生物技术方法培育有香型杜鹃花，为今后利用基因工程技术改良杜鹃花品质提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。本发明专利技术为后续云锦杜鹃花瓣TPS基因的确切功能和参与的萜烯类化合物代谢调控途径等的研究奠定基础。础。础。

【技术实现步骤摘要】
云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是一种云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用。

技术介绍

[0002]杜鹃花是杜鹃花科、杜鹃花属常绿或落叶灌木，也是世界著名的观赏花卉，广泛应用于园林种植和室内美化，但是目前对杜鹃花香及香气形成机理的研究却鲜有报道。我国具有丰富的杜鹃花资源，但是只有极少数杜鹃品种可以产生花香，如高山杜鹃品种—云锦杜鹃。花香是观赏性植物的重要性状，是评价花卉品质的主要依据之一。花香是植物散发出的挥发性低分子量混合物，植物的部分营养器官及花器官都可以散发芳香物质。花的香气排放量根据花的发育阶段而有所不同，花香可以吸引昆虫完成授粉，抵御生物胁迫以及环境变化引起的自然胁迫等。相对于花型、花色等易于观察的植物性状，目前对花香的研究相对滞后。
[0003]根据花香化合物成分分析，植物香气成分中主要物质为萜烯类化合物，植物香气中萜类化合物种类多样。拟南芥基因组序列分析结果显示，不同种萜烯类合酶基因中，75％萜烯类合酶基因的基因结构和序列相关性具有相似性，体现在结构和功能方面的差异性。萜烯类化合物是桂花、百合、康乃馨等具香气植物的香气化合物中的主要成分，萜烯合酶(Terpene synthase,TPS)是萜烯类化合物生物合成的重要酶。
[0004]研究发现香气植物的TPS基因对花香化合物的形成及香气释放具有重要影响，但对云锦杜鹃花中相关TPS基因的研究以及TPS基因与萜烯类化合物合成的关系的研究还没有报道，有必要对云锦杜鹃TPS基因的克隆及其他分子进行研究，因此本专利技术提出一种用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种云锦杜鹃花TPS基因、用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物及其克隆方法和应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：云锦杜鹃花TPS基因，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]云锦杜鹃花TPS基因，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]进一步地，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个碱基且具有萜烯合酶活性的基因序列。
[0009]云锦杜鹃花TPS基因，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]进一步地，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的氨
基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有萜烯合酶活性的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。
[0011]用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物组，该引物组包括TPS-F1、TPS-R1、TPS-F2、TPS-R2、TPS-F3和TPS-R3，其中TPS-F1和TPS-R1用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，TPS-F2和TPS-R2用于扩增SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，TPS-F3和TPS-R3为根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计并用于qRT-PCR扩增的核苷酸序列，该引物组的序列如下：
[0012]TPS-F1：CTCATTGACWCWATKCAAMGGY；
[0013]TPS-R1：CTTRGAAGTKCCCAAATCATCA；
[0014]TPS-F2：CCAGGTCCATCCACCACTTGGCTAGTTCTTGTA；
[0015]TPS-R2：ACGCTTGCCTCTTGCTAGGGTCTCCGATAA；
[0016]TPS-F3：CGCCAGAACTTTCAGTGTCAAGCATTT；
[0017]TPS-R3：TCGTGCTTCTAACCTCGGCATTCT。
[0018]云锦杜鹃花TPS基因的克隆方法，包括以下步骤：
[0019]步骤一、采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取云锦杜鹃花花瓣总RNA，分别用质量浓度1.5％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪测定总RNA的完整性和浓度，按照TransScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒的说明书合成cDNA第一链；
[0020]步骤二、从GenBank中下载与杜鹃花属植物亲缘关系相近植物的TPS基因全长序列，采用ClustalW进行多序列比对，在同源性较高的序列利用Primer 5.0设计简并引物TPS-F1和TPS-R1，引物组TPS-F1和TPS-R1的序列为：
[0021]TPS-F1：CTCATTGACWCWATKCAAMGGY；
[0022]TPS-R1：CTTRGAAGTKCCCAAATCATCA；
[0023]步骤三、以cDNA第一链为模板，利用简并引物TPS-F1和TPS-R1进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应的反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30Cycles；72℃5min，得到PCR产物；PCR产物经回收、pMD18-T Vector Cloning Kit连接、DH5α感受态细胞转化、重组子筛选及菌液PCR鉴定后进行序列测定，获得云锦杜鹃花萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1。
[0024]进一步地，根据云锦杜鹃花萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列设计RACE扩增引物TPS-F2和TPS-R2，TPS-F2和TPS-R2的序列为：
[0025]TPS-F2：CCAGGTCCATCCACCACTTGGCTAGTTCTTGTA；
[0026]TPS-R2：ACGCTTGCCTCTTGCTAGGGTCTCCGATAA；
[0027]分别扩增萜烯合酶基因RhTPS的5
′
末端全长和3
′
末端全长，方法为：按照SMARTer RACE 5
′
/3
′
Kit RACE试剂盒的说明书合成RACE-cDNA，分别得到5'cDNA和3'cDNA；以5'cDNA为模板，利用RACE通用引物UPM和TPS-R2对5
′
末端全长进行PCR扩增反应，得到5'末端全长的特异性引物；以3'cDNA为模板，利用RACE通用引物UPM和TPS-F2对3
′
末端全长进行PCR扩增反应，得到3'末端全长的特异性引物；利用DNAMAN软件将保守域序列、5
′
末端全长序列和3
′
末端全长序列进行比对拼接，得到全长1826bp的序列为SEQ ID NO.2的全长核苷酸序列；编本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述的云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个碱基且具有萜烯合酶活性的基因序列。4.云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，该基因为萜烯合酶基因RhTPS，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求4所述的云锦杜鹃花TPS基因，其特征在于，所述的萜烯合酶基因RhTPS的全长氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有萜烯合酶活性的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。6.用于克隆云锦杜鹃花TPS基因的引物组，其特征在于，该引物组包括TPS-F1、TPS-R1、TPS-F2、TPS-R2、TPS-F3和TPS-R3，其中TPS-F1和TPS-R1用于扩增SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，TPS-F2和TPS-R2用于扩增SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，TPS-F3和TPS-R3为根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列设计并用于qRT-PCR扩增的核苷酸序列，该引物组的序列如下：TPS-F1：CTCATTGACWCWATKCAAMGGY；TPS-R1：CTTRGAAGTKCCCAAATCATCA；TPS-F2：CCAGGTCCATCCACCACTTGGCTAGTTCTTGTA；TPS-R2：ACGCTTGCCTCTTGCTAGGGTCTCCGATAA；TPS-F3：CGCCAGAACTTTCAGTGTCAAGCATTT；TPS-R3：TCGTGCTTCTAACCTCGGCATTCT。7.云锦杜鹃花TPS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取云锦杜鹃花花瓣总RNA，分别用质量浓度1.5％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪测定总RNA的完整性和浓度，按照TransScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒的说明书合成cDNA第一链；步骤二、从GenBank中下载与杜鹃花属植物亲缘关系相近植物的TPS基因全长序列，采用ClustalW进行多序列比对，在同源性较高的序列利用Primer 5.0设计简并引物TPS-F1和TPS-R1，引物组TPS-F1和TPS-R1的序列为：TPS-F1：CTCATTGACWCWATKCAAMGGY；TPS-R1：CTTRGAAGTKCCCAAATCATCA；步骤三、以cDNA第一链为模板，利用简并引物TPS-F1和TPS-R1进行PCR扩增反应，所述的PCR扩增反应的反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30Cycles；72℃5min，得到PCR产物；PCR产物经回收、pMD18-T Vector Cloning Kit连接、DH5α感受态细胞转化、重组子筛选及菌液PCR鉴定后进行序列测定，获得云锦杜鹃花萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列，即SEQ ID NO.1。8.根据权利要求7所述的云锦杜鹃花TPS基因的克隆方法，其特征在于，根据云锦杜鹃花萜烯合酶基因RhTPS保守域的核苷酸序列设计RACE扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文静，吴月燕，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：