寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法技术

本发明专利技术提供以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段、其制造方法、使用其的寡核苷酸合成方法。式中，B为保护/未保护核苷碱基，R1为保护基，R2、R3、R4为OCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2等，R5为取代/未取代的脂肪族基团/芳香族基团；X为未共用电子对、O、S；Y为NHR6、卤素、CN等或被酰基类、醚类、硅烷基类保护基保护的羟基，R6为H、脂肪族基团、芳香族基团；Z为H、烷基、O

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法


[0001]本专利技术涉及寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法。

技术介绍

[0002]近年来，对于以天然型或非天然型寡核苷酸为基本骨架的核酸药物的关注度不断提高。为了获得为实现目标作用而设计的核酸药物，使用采用化学合成法的制造方法。
[0003]采用以往方法的寡核苷酸合成中，主要采用以单体亚磷酰胺为原料，每次1个碱基逐步进行偶联反应，逐渐伸长核苷酸的长度的方法(参照非专利文献1)。寡核苷酸合成中的每次1个的伸长时，除了使单体亚磷酰胺与核苷的5'-羟基反应的偶联反应之外，还需要氧化或硫化3价磷的工序和以备后续的偶联反应而对核苷的5'羟基的保护基进行脱保护的工序。
[0004]现有技术文献
[0005]非专利文献
[0006]非专利文献1:Caruthers等，Bioactive Molecules，3，第3-21页(1987)

技术实现思路

[0007]专利技术所要解决的技术问题
[0008]然而，使用以往方法中所用的原料的情况下，上述寡核苷酸合成中的各偶联反应的收率并不一定达到100％。因此，难以高效地合成具有一定程度的长度的寡核苷酸。
[0009]偶联反应之后的氧化/硫化工序、脱保护工序也不一定以100％进行。因此，作为目标的寡核苷酸的长度越长，则具有作为目标的长度的寡核苷酸的收率越低。
[0010]另外，在最终获得具有目标长度的寡核苷酸的阶段，需要进行除去如上所述的各工序中生成的副产物和试剂残渣的纯化工序。作为合成寡核苷酸N聚体的情况下生成的每次伸长1个碱基的合成方法中的代表性的副产物，有偶联工序中生成的短1个碱基的(N-1)聚体、短2个碱基的(N-2)聚体等。这样的(N-1)聚体、(N-2)聚体的结构和物性与作为目标的N聚体非常类似。因此，在使用色谱法等纯化N聚体的阶段，作为目标的N聚体的迁移率与作为副产物的(N-1)聚体、(N-2)聚体等的迁移率的差小。由此，存在用于将N聚体与其他物质准确分离的纯化负荷大的问题。
[0011]此外，广泛采用的寡核苷酸合成中，使用对于将3'-末端固定于固相载体的核苷沿5'-方向进行链伸长的固相合成法。该方法中，需要购入用于固相合成的单体亚磷酰胺的市售品，或者实验者自行制备。一般来说，市售的单体亚磷酰胺价格昂贵，成为大量合成作为目标的核苷酸的障碍。此外，实验者自行制备的情况下，需要预先高纯度且高收量地准备作为目标的单体亚磷酰胺。这是因为如果单体核苷酸不是高纯度，则很可能会对寡核苷酸合成中的偶联反应造成影响。
[0012]本专利技术鉴于这样的情况而进行，其目的在于提供可更简便地纯化且能够大量供给的寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法。
[0013]解决技术问题所采用的技术方案
[0014]为了解决上述课题，本专利技术的寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法采用以下的手段。
[0015]本专利技术的第一种形态为以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段。
[0016][化1][0017][0018]所述式(I)中，B独立为保护或未保护核苷碱基，R1为保护基，R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH3CN、OCH2CH＝CH2、OCH3，R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为未共用电子对、＝O或＝S，Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，R6为H、脂肪族基团、芳香族基团，Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素，或者在与所述Y之间形成Z-Y键，(m+n)为2以上且23以下的整数。
[0019]上述第一种形态中，所述式(I)中的B为被保护基保护的核苷碱基时，该保护基可以是酰基类保护基。
[0020]上述第一种形态中，所述式(I)中，可以是所述R1为在酸性条件下可除去的保护基或三烷基硅烷基，所述Y较好是H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，所述Z较好是H，所述R5为异丙基。
[0021]本专利技术的第二种形态为以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的制造方法。
[0022][化2][0023][0024]所述式(I)中，B独立为保护或未保护核苷碱基，R1为保护基，R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH3CN、OCH2CH＝CH2、OCH3，R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为未共用电子对、＝O或＝S，Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基，R6为H、脂肪族基团、芳香族基团，Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素，或者在与所述Y之间形成Z-Y键，(m+n)为2以上且23以下的整数。
[0025]所述制造方法包括：
[0026](a)使以下述式(II):
[0027][化3][0028][0029]表示的核苷与具有R2P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物和具有下述式(I II):
[0030][化4][0031][0032]的结构的核苷反应，制备具有下述式(IV):
[0033][化5][0034][0035]的结构的化合物的工序；
[0036](b)使具有所述式(IV)的结构的化合物与具有R3P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物和具有上述式(III)的结构的核苷或具有下述式(V):
[0037][化6][0038]的结构的化合物或具有下述式(VI):
[0039][化7][0040]的结构的化合物反应，制备具有下述式(VII):
[0041][化8][0042][0043]的结构的化合物的工序；
[0044](c)根据需要重复所述工序(b)至少1次的工序；
[0045](d)使所得的中间体与具有R4P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物反应，制备具有所述式(I)的结构的片段的工序。
[0046]上述第二种形态中，所述式(I)中的B为被保护基保护的核苷时，该保护基可以是酰基类保护基。
[0047]所述第二种形态中，所述式(I)中，可以是所述R1为在酸性条件下可除去的保护基或三烷基硅烷基，所述Y较好是H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，所述Z较好是H，所述R5为异丙基。
[0048]所述第二种形态中，可包括：根据需要使氧化剂或硫化剂与所述工序(a)中得到的以式(IV)表示的化合物或所述工序(b)中得到的以式(VII)表示的化合物反应的工序。
[0049]本专利技术的第三种形态为一种使用以上述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的寡核苷酸的合成方法。
[0050]所述合成方法包括：(a)所述以式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的亚磷酰胺部分与核苷或核苷酸的羟基的缩合工序、(b)所述缩合工序中得到的亚磷酸键部分的氧化工序、(c)所述缩合工序中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段，其中，[化1]式中，B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；R1为保护基；R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为未共用电子对、＝O或＝S；Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基；R6为H、脂肪族基团、芳香族基团；Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素，或者在与所述Y之间形成Z-Y键；(m+n)为2以上且23以下的整数。2.根据权利要求1所述的寡核苷酸合成用片段，其中，所述式(I)中，所述B为被保护基保护的核苷碱基时，该保护基为酰基类保护基。3.根据权利要求1所述的寡核苷酸合成用片段，其中，所述式(I)中，R1为在酸性条件下可除去的保护基或三烷基硅烷基，所述Y为H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基，所述Z为H，所述R5为异丙基。4.一种以下述式(I):[化2]
表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的制造方法，其中，式中，B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基；R1为保护基；R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH＝CH2、OCH3；R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团；X独立为未共用电子对、＝O或＝S；Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基；R6为H、脂肪族基团、芳香族基团；Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素，或者在与所述Y之间形成Z-Y键；(m+n)为2以上且23以下的整数，该制造方法包括：(a)使以下述式(II):[化3]表示的核苷与具有R2P{N(R...

【专利技术属性】
技术研发人员：片冈正典，
申请(专利权)人：株式会社纳蒂亚斯，
类型：发明
国别省市：