一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法技术

本发明专利技术提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，属于生物技术领域。该检测方法使用引物A1F、A1R和探针AP1，引物B3F、B3R和探针BP3。引物A1F、A1R的序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法。

技术介绍

[0002]豌豆细菌性疫病的病原菌为丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.pisi)，属于薄壁菌门(Gracilicutes)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的致病变种，革兰氏阴性菌。该病菌主要寄主为豌豆(Pisum sativum)，自然条件下也可侵染扁豆(Lablab purpureus)、山黧豆(Lathyrus odoratus)、宽叶山黧豆(L.latifolius)、野豌豆属(Vicia spp.)和孟加拉野豌豆(V.benghalensis)。该病菌可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死，导致植株猝倒，早期侵染可造成严重损失，对产量影响较大。
[0003]豌豆细菌性疫病为我国禁止进境植物检疫性细菌病害，1915年首次报道在美国科罗拉多州发生,随后该病害迅速扩散至世界各豌豆重要生产区，我国尚无分布。
[0004]豌豆细菌性疫病菌主要随种子进行远距离传播，病菌在种子表面或种子内部可存活数个生长季节，经表面药剂处理后的种子内部仍有病菌存活，因此极难防治。
[0005]豌豆是我国第一大食用豆进口品种，中国是全球第二大进口国，加拿大、美国是我国的豌豆主要进口国。豌豆细菌性疫病在加拿大广泛分布，美国的加利福利亚州、科罗拉多州、堪萨斯州、纽约州、华盛顿州、威斯康辛州均有分布。海关从加拿大进口豌豆中多次检出过该病菌，因此，该病菌随进口豌豆等大宗农产品传入、定殖和扩散的可能性都很大，并可随种子的调运在国内传播。因此，豌豆细菌性疫病病原菌已成为我国豌豆生产潜在的巨大威胁。
[0006]丁香假单胞菌P.syringae寄主范围广，常见的致病变种已达60多种，种内致病变种的区分和鉴定一直是植物病原细菌鉴定中的难点。因寄主范围相近，在对进口豌豆疫情检测中，丁香假单胞菌豌豆致病变种与丁香致病变种、菜豆变种、大豆变种常常并存，难以区分。同时，丁香假单胞菌豌豆致病变种根据8个不同豌豆栽培种无毒基因(A)与抗性基因(R)的相互作用被分为8个生理小种。根据病原菌特异性片段，并以此设计引物进行PCR扩增，8个生理小种分别扩增出272bp或132bp片段，因此将8个生理小种分为两个系统发育群，I群为1、3B、4B、5、7生理小种，II群为2、3A、4A、6、8生理小种。从现有研究资料来看，II群相对来说更常见。对致病变种的鉴定，采用生理生化方法耗费时间较长，同时一些理化鉴定结果易于因为主观上的差异从而不能客观反应不同致病变种之间的差异。近些年，在分子生物学检测方法上，进行了较多的尝试，但存在特异性不足、耗时较长等问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方
法，可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测。
[0008]本专利技术的目的采用如下技术方案实现：
[0009]用于丁香假单胞菌豌豆致病变种的组合物，包括组合物1和组合物2，所述组合物1含有引物A1F、A1R和探针AP1，所述组合物2含有引物B3F、B3R和探针BP3；所述引物A1F、A1R的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TaqMan探针AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，TaqMan探针AP1的5
’
端结合有荧光发光基团FAM，3
’
端结合有荧光猝灭基团TAMRA；引物B3F、B3R的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，TaqMan探针BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，TaqMan探针BP3的5
’
端结合有荧光发光基团FAM，3
’
端结合有荧光猝灭基团TAMRA。
[0010]在本专利技术中，丁香假单胞菌豌豆致病变种包括I群和II群。
[0011]本专利技术还提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，包含如下步骤：
[0012](1)将豌豆样品采用生理盐水浸泡过夜，离心取沉淀，提取基因组DNA；
[0013](2)以所述基因组DNA为模板，采用引物B3F、B3R和探针BP3进行微滴式数字PCR检测；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则进行步骤(3)；
[0014](3)以所述基因组DNA为模板，采用引物A1F、A1R和探针AP1进行微滴式数字PCR检测；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则样品中无丁香假单胞菌豌豆致病变种。
[0015]在本专利技术中，所述丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，其特征在于微滴式数字PCR检测中的反应体系包括：10μL的ddPCR supermix(2
×
)、0.4μL的上游引物、0.4μL的下游引物、0.2μL的TaqMan探针、2μL基因组DNA和7μL的ddH2O。
[0016]在本专利技术中，微滴式数字PCR检测中的反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。
[0017]本专利技术丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，使用病原菌DNA测试至结束，不超过两小时即可得出结论,因此可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测，无需外部标准等优点。本专利技术适合对进境豌豆种子中豌豆疫病菌的检测，尤其适合细菌浓度较低时的检测，具有良好的应用前景。
[0018]本申请相关研究由南京海关科技计划资助项目2018KJ57资助。
附图说明
[0019]图1豌豆细菌性疫病菌I型特异性检测图，上面的横坐标表示样品编号，A08、E08、F08、G08、H08分别是丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生理小种1、丁香假单胞菌豌豆致病变种II群生理小种2、丁香假单胞菌菜豆致病变种(P.savastanoi pv.phaseolicola)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)和瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)。纵坐标代表微滴数(0以上表示阳性微滴数，0以下表示阴性微滴数)。
[0020]图2显示了采用微滴式数字PCR分子检测方法对丁香假单胞菌豌豆致病变种I群生
理小种1的最低检测浓度，上面的横坐标表示样品编号，A08、B08、C08、D08、E08、F08、G08、H08分别是浓度为0.1ng/ul、0.01ng/ul、0.001ng/ul、0.0001ng/u本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于丁香假单胞菌豌豆致病变种的组合物，其特征在于包括组合物1和组合物2，所述组合物1含有引物A1F、A1R和探针AP1，所述组合物2含有引物B3F、B3R和探针BP3；所述引物A1F、A1R的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TaqMan探针AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，TaqMan探针AP1的5
’
端结合有荧光发光基团FAM，3
’
端结合有荧光猝灭基团TAMRA；引物B3F、B3R的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，TaqMan探针BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，TaqMan探针BP3的5
’
端结合有荧光发光基团FAM，3
’
端结合有荧光猝灭基团TAMRA。2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于丁香假单胞菌豌豆致病变种包括I群和II群。3.一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，其特征包含如下步骤：(1)将豌豆样品采用生理盐水浸泡...

【专利技术属性】
技术研发人员：许萍萍，李彬，杨静，钱茱希，刘晓宇，周密密，何丹军，吴翠萍，
申请(专利权)人：中华人民共和国金陵海关，
类型：发明
国别省市：