一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物药物载体制备领域，公开了一种连接CD22

【技术实现步骤摘要】
一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物药物载体制备领域，涉及一种靶向中枢神经系统的外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)为一种高度侵袭性的非霍奇金淋巴瘤，90％以上亚型为弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。原发性中枢神经系统淋巴瘤约占颅内原发肿瘤的1％-5％、所有淋巴瘤的1％。由于血脑屏障的存在，诸多可应用于DLBCL的药物难以抵达颅内病灶，原发性中枢神经系统淋巴瘤的五年生存率仅为20％-30％，且大约25％的PCNSL出现原发耐药，近50％最终会复发。目前治疗均需超大剂量化疗药物以保证进入中枢的化疗药物达到有效血药浓度，因而化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，往往对正常组织和器官造成不可逆的损害，降低人体免疫能力，达不到预期治疗效果。
[0003]应用纳米载体携载化疗药物穿越血脑屏障是中枢性疾病治疗的有效方法。然而，目前利用高分子材料构建的纳米载药体系存在着一些不易解决的问题，如生物相容性较差、对疏水性药物的释放存在一定影响、稳定性差等。故具有良好生物利用度且可将细胞毒性药物有效运输至中枢神经系统淋巴瘤的外泌体(Exo)具备成为新型生物载体的优异潜质。
[0004]外泌体来源广泛，在血液中稳定性高，体内循环时间长，免疫原性低，有更高的药物传输效率及更强的增强渗透滞留效应，这些特性使其有可能成为一种天然的内源性药物载体。其次，外泌体表面存在多种黏附蛋白和特定的载体配体，可避免调理素、凝血因子或补体的激活，使载体避免被网状内皮系统捕获；且外泌体为磷脂双分子层膜结构，易于与受体细胞融合，有助于其运送并释放内容物至靶细胞。此外，外泌体为直径大小约为40～150nm的小囊泡，外泌体可有效利用增强渗透滞留效应，通过细胞间间隙透出血管，选择性地渗入肿瘤组织部位并滞留，从而进一步实现对肿瘤的被动靶向作用。尤其值得关注的是，纳米级的外泌体可穿越血脑屏障及血脑脊液屏障。
[0005]由于90％以上的B细胞淋巴瘤细胞上有CD22抗原表达，且CD22抗原的表达率为80％-100％，远高于正常成熟B淋巴细胞，并且结合CD22的抗体可以被迅速内化，因此anti-CD22作为化学免疫偶联物也引起瞩目，被应用于将细胞毒性药物靶向递送至肿瘤细胞。然而，完整的CD22mAb具有的Fc段易被单核吞噬细胞吞噬、清除，从而导致药物靶向的效率低，精准性查。因此，亟需研发针对中枢神经系统淋巴瘤、可有效穿越血脑屏障的且靶向效率高的新型靶向治疗策略。

技术实现思路

[0006]为克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种以连接CD22-F(ab
’
)2抗体片段的外泌体，以及其制备方法，同时作为药物载体包载抗肿瘤药物的应用，制成携载抗肿瘤药物连接CD22-F(ab
’
)2抗体片段的外泌体靶向载药体系，具有生物相容性好、载药率高、主
动靶向性强、在肿瘤组织的酸性环境中释放率高，从而增加药物的抗肿瘤活性等优点。
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体，所述外泌体表面经过CD22-F(ab
’
)2抗体片段修饰。
[0008]第二方面，本专利技术还提供了第一方面所述的靶向淋巴瘤细胞的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0009]步骤S1：外泌体纯化及表面修饰，得到表面修饰的外泌体；
[0010]步骤S2：富含巯基的CD22-F(ab
’
)2抗体片段的制备；
[0011]步骤S3：将所述表面修饰的外泌体与所述CD22-F(ab
’
)2抗体片段混合，在37
±
0.5℃的避光环境中震荡反应12～18小时，经超滤离心洗涤，得到连接CD22-F(ab
’
)2抗体片段的外泌体。
[0012]进一步地，所述步骤S1具体操作为，
[0013]步骤S11：提取外泌体前12-48h，将外泌体来源细胞的培养液更换为不含血清的培养基，培养24-48h后，收集细胞悬液；
[0014]步骤S12：将所述步骤S11得到的细胞悬液离心，取上清后进行第二次离心，再取上清；第三次离心后，将上清移至100kD超滤管中离心浓缩，将浓缩液超高速离心后吸弃上清，重悬洗涤后，再次超高速离心，吸弃上清，1
×
PBS溶液重悬，得到分离纯化的外泌体悬液；
[0015]步骤S13：将所述步骤S12得到的外泌体悬液与3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)试剂在37
±
0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，通过超高速离心法离心纯化得到表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体。
[0016]进一步地，所述外泌体来源细胞为人肾上皮细胞系的293T细胞。
[0017]进一步地，所述步骤S12中，细胞悬液离心以300g，10min，4℃条件进行，第二次离心以2000g，10min，4℃条件进行，第三次离心以12000g，30min，4℃进行。
[0018]进一步地，所述步骤S13中，外泌体悬液与MBS试剂体积比为50：1。
[0019]进一步地，所述步骤S2具体操作为，
[0020]步骤S21：使用无花果蛋白酶水解anti-CD22单抗得到F(ab
’
)2抗体片段，随后将该反应体系纯化分离，再通过高效液相色谱法收集第一个蛋白峰，得到CD22-F(ab
’
)2抗体片段；
[0021]步骤S22：将所述CD22-F(ab
’
)2抗体片段与Traut
’
s试剂在37
±
0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，超滤离心，得到富含巯基的CD22-F(ab
’
)2抗体片段；
[0022]进一步地，所述步骤S21中的水解条件为：pH6.0下，10mM柠檬酸盐缓冲液中加入4mM半胱氨酸和5mM EDTA，与无花果蛋白酶及anti-CD22单抗在37℃下共同孵育24小时。
[0023]进一步地，所述步骤S22中CD22-F(ab
’
)2抗体片段与Traut
’
s试剂的浓度比为50:1。
[0024]第三方面，本专利技术提供了采用本专利技术第二方面所述的方法制备得到的外泌体。
[0025]第四方面，本专利技术还提供了第三方面所述的外泌体在制备靶向淋巴瘤细胞载药体系中的应用。
[0026]进一步地，所述应用具体为，将所述连接CD22-F(ab
’
)2抗体片段的外泌体与抗肿瘤药物在37
±
0.5℃的共孵育。
[0027]进一步地，所述抗肿瘤药物为蒽环类抗肿瘤药物或烷化剂类抗肿瘤药物的任一
种，抗肿瘤药物的浓度为1～2mg/mL。
[0028]进一步地，所述抗肿瘤药物为阿霉素或环磷酰胺。
[0029]进一步地，所述抗肿瘤药物与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向淋巴瘤细胞的外泌体，其特征在于，所述外泌体表面经过CD22-F(ab
’
)2抗体片段修饰。2.权利要求1所述的靶向淋巴瘤细胞的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:步骤S1：外泌体纯化及表面修饰，得到表面修饰的外泌体；步骤S2：富含巯基的CD22-F(ab
’
)2抗体片段的制备；步骤S3：将所述表面修饰的外泌体与所述CD22-F(ab
’
)2抗体片段混合，在37
±
0.5℃的避光环境中震荡反应12～18小时，经超滤离心洗涤，得到连接CD22-F(ab
’
)2抗体片段的外泌体。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体操作为，步骤S11：提取外泌体前12-48h，将外泌体来源细胞的培养液更换为不含血清的培养基，培养24-48h后，收集细胞悬液；步骤S12：将所述步骤S11得到的细胞悬液离心，取上清后进行第二次离心，再取上清；第三次离心后，将上清移至100kD超滤管中离心浓缩，将浓缩液超高速离心后吸弃上清，重悬洗涤后，再次超高速离心，吸弃上清，1
×
PBS溶液重悬，得到分离纯化的外泌体悬液；步骤S13：将所述步骤S12得到的外泌体悬液与3-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)试剂在37
±
0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，通过超高速离心法离心纯化得到表面修饰马来酰亚胺基团的外泌体。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述外泌体来源细胞为人肾上皮细胞系的293T细胞。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S12中，细胞悬液离心以300g，10min，4℃条件进行，第二次离心以2000g，10min，4℃条件进行，第三次离心以12000g，30min，4℃进行。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S13中...

【专利技术属性】
技术研发人员：许佩佩，柳旭，夏天，陈兵，欧阳建，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：