一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用，属于全细胞疫苗技术领域，所述融合蛋白，包括顺次链接的CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域；本发明专利技术将S2单独进行跨膜的细胞表达，避免了其他S蛋白表位可能导致的ADE风险，本发明专利技术提供的融合蛋白构建的细胞疫苗在小鼠体内可以诱发出更高的中和抗体滴度。更高的中和抗体滴度。

【技术实现步骤摘要】
一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用


[0001]本专利技术属于全细胞疫苗
，尤其涉及一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)是一种β属的冠状病毒，感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状；部分患者会产生严重的肺炎，进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，甚至死亡。SARS-CoV-2病毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞，从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细胞。SARS-CoV-2的囊膜蛋白即刺突蛋白(Spike protein,S)是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。
[0003]S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。RBD与细胞表面血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合，使病毒和受体相互作用，是病毒入侵细胞的第一步。S2介导病毒膜和人呼吸道水平细胞和肺泡细胞膜的融合，最终使病毒入侵宿主细胞。虽然RBD是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点，但是RBD在不同冠状病毒之间变异大，不具有保守性，设计的疫苗不具有通用性。
[0004]由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于SARS-CoV-2病毒感染的治疗和预防，因此开发针对SARS-CoV-2病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至关重要的。然而，将病毒的全长蛋白作为临床使用的抗原可以引起部分对于病毒的预防作用，但也常见到临床报道有抗体依赖性增强(Antibody-dependent enhancement，简称ADE)作用，从而有可能产生比未用疫苗者更加严重的病毒感染。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用；本专利技术将S2单独进行跨膜的细胞表达，避免了其他S蛋白表位可能导致的ADE风险，本专利技术提供了一种新的融合蛋白，所述融合蛋白构建的细胞疫苗在小鼠体内可以诱发出更高的中和滴度。同时，本专利技术以高保守性的S2为靶点(与RaTG13和SARS CoV S2进行比较，一致性为96.49％，见图8)，设计疫苗，具有靶向不同冠状病毒的通用性。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白，包括顺次链接的CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域。
[0008]优选的，所述CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示。
[0009]优选的，所述CD4跨膜结构域分别替换为CD80跨膜结构域或者CD86跨膜结构域。
[0010]优选的，所述CD80跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述CD86跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0011]本专利技术提供了编码所述融合蛋白的基因，包括顺次连接的如SEQ ID No.7～SEQ ID No.10所示的编码CD4信号肽的核苷酸序列、编码新型冠状病毒抗原S2蛋白的核苷酸序列、Flag标签序列的核苷酸序列和编码CD4跨膜结构域的核苷酸序列。
[0012]本专利技术提供了编码所述融合蛋白的基因，编码CD80跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；编码CD86跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
[0013]本专利技术还提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白的重组载体，包括初始载体和所述编码融合蛋白的基因。
[0014]优选的，所述初始载体为PB-713质粒或pCDH-K载体；所述编码融合蛋白的基因重组于PB-713质粒的Bsu36I和BmgBI酶切位点之间；所述编码融合蛋白的基因重组于pCDH-K载体的EcoRI和BamHI酶切位点之间。
[0015]本专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2融合蛋白的重组树突状细胞，通过将所述的重组载体转入树突状细胞获得。
[0016]本专利技术提供了所述的融合蛋白、所述编码融合蛋白的基因、所述重组载体、所述的重组树突状细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
[0017]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用；本专利技术提供的冠状病毒刺突糖蛋白中S2亚基内部包含FP(Fusion Peptide)，SH(Stem Helix)和HR2(Heptad Repeat 2)等结构域在介导病毒膜与宿主细胞膜的融合过程起到关键作用；所述S2蛋白具有免疫原性强、在冠状病毒之间保守度高、在诱导中和抗体方面效果突出的优势，由S2蛋白诱导产生的中和抗体可以通过阻止病毒膜与宿主细胞膜的融合而防止病毒侵入。本专利技术通过将所述S2蛋白与不同跨膜蛋白结构(CD4、CD80和CD86)融合表达，实现了S2蛋白的高效跨膜表达，相对于天然的S蛋白三聚体，本专利技术中的融合蛋白跨膜表达能力更强。
[0018]本专利技术采用所述重组树突状细胞免疫动物获得的中和抗体滴度更高，远远高于以S2蛋白免疫动物或者以表达S2蛋白天然构象的细胞免疫动物获得的中和抗体滴度。
附图说明
[0019]图1为流式分析检测DC对照细胞中S2的表达量；
[0020]图2为流式分析检测DC-S细胞中S2的表达量；
[0021]图3为流式分析检测DC-S2细胞中S2的表达量；
[0022]图4流式分析检测DC-S2-CD4细胞中S2的表达量；
[0023]图5流式分析检测DC-S2-CD80细胞中S2的表达量；
[0024]图6流式分析检测DC-S2-CD86细胞中S2的表达量；
[0025]图7为抗体IgG的ELISA检测；其中A为以新型冠状病毒刺突蛋白全长蛋白进行ELISA检测；B为以新冠冠状病毒膜结合结构域S2进行ELISA检测；
[0026]图8为RaTG13、SARS-CoV和SARS-CoV2 S2的序列比对结果。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白，包括顺次链接的CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域。
[0028]在本专利技术中，所述CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域的氨基酸序列优选的如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示；具体如下：
[0029]CD4信号肽：MNRGVPFRHLLL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白，其特征在于，包括顺次链接的CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.4所示。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD4跨膜结构域替换为CD80跨膜结构域或者CD86跨膜结构域。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD80跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述CD86跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。5.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因，其特征在于，包括顺次连接的如SEQ ID No.7～SEQ ID No.10所示的编码CD4信号肽的核苷酸序列、编码新型冠状病毒抗原S2蛋白的核苷酸序列、Flag标签序列的核苷酸序列和编码CD4跨膜结构域的核苷酸序列。6.编码权利要求3或4所述融合蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，陈静远，汪坤福，袁翰，张艳玲，李斯慧，冯向辉，宋文静，吕鹏敏，钟宏东，胡坤，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：