【技术实现步骤摘要】
一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其应用
[0001]本专利技术属于分子生物学和生物检测领域，尤其涉及一种引物设计灵活的多功能DNA恒温扩增方法及其在DNA检测中的应用。
技术介绍
[0002]核酸体外扩增是分子生物学研究的基础，随着生物技术的发展，出现了越来越多的核酸体外扩增技术，如聚合酶链式反应、环介导的等温扩增、滚环扩增、依赖解旋酶的DNA等温扩增等。核酸体外扩增是核酸分析中的一个重要环节，是方法灵敏度、特异性等重要技术参数指标的保证。
[0003]聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是根据靶基因序列设计1对特异的引物，在体外模拟DNA的天然复制的过程，其特异性依赖于针对靶序列的引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成，在2-3小时内即实现对靶基因几百万倍的扩增放大。该技术依赖于特殊精密的热循环设备，反应所需的时间较长，导致检测总成本高，不适用于样品的快速检测。
[0004]滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）依赖于环状模板，但绝大多数基因组DNA为线性分子，且合成滚环扩增锁式探针的成本高，存在信号背景问题。依赖解旋酶的DNA等温扩增（helicase-dependent amplification，HDA）则受到DNA解旋酶的限制，主要用于扩增小片段的DNA序列。
[0005]环介导的等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种在...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种DNA恒温扩增方法，所述方法包括：（1）制备反应混合物，其中所述反应混合物包含待扩增的DNA、第一引物对、第二引物对、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一条引物各自包含与所述第一引物对中的每一条引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个；（2）将步骤（1）获得的反应混合物置于恒定温度下，在识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能DNA聚合酶的作用下，第一引物对和第二引物对以待扩增的DNA为模板进行DNA扩增。2.根据权利要求1所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规DNA碱基选自：5-羧基胞嘧啶、乙烯基胞嘧啶、乙烯基腺嘌呤、3-甲基腺嘌呤、7-甲基腺嘌呤、3-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤、脱氧次黄嘌呤、8-氧鸟嘌呤，及其任意组合。3.根据权利要求1或2所述的DNA恒温扩增方法，其中所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V；更优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的DNA恒温扩增方法，其中所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合酶（例如Deep Vent聚合酶、Vent（-exo）聚合酶、Deep Vent（-exo）聚合酶）、9
°
Nm聚合酶、Klenow DNA聚合酶、T7 phase DNA聚合酶变种（缺少3
’-5’
外切酶活性）、超保真DNA聚合酶、Taq聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶、LongAmpTaq DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、TopoTaq DNA聚合酶，及其任意组合。5.根据权利要求1至4中任一项所述的DNA恒温扩增方法，其中所述非常规碱基修饰区和识别区的长度分别为12-30个碱基；优选地，所述非常规碱基均匀地分布在所述非常规碱基修饰区中。6.根据权利要求1至5中任一项所述的DNA恒温扩增方法，其中所述反应混合物进一步包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间；优选地，所述反应混合物进一步包含一种或多种选自下组的成分：Mg
2+
、K
+
、NH
4+
、H
+
、Cl-、SO
42-、Tris-HCl和细胞表面活性剂；优选地，所述细胞表面活性剂为Triton X-100；优选地，Mg
2+
的浓度为6 mM-10 mM；K
+
的浓度为4 mM-8 mM；NH
4+
的浓度为6 mM-15 mM；H
+
的浓度为15 mM-25 mM；Cl-的浓度为4 mM-8 mM；SO
42-的浓度为6 mM-15 mM；Tris-HCl的浓度为15 mM-25 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL-0.02 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.0 mM-2.0 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的浓度为40 U/mL-100 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为300 U/mL-350 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；第二引物对的浓度为0.2 μM-1.0 μM；
更优选地，Mg
2+
的浓度为8 mM；K
+
的浓度为6 mM；NH
4+
的浓度为10 mM；H
+
的浓度为20 mM；Cl-的浓度为6 mM；SO
42-的浓度为10 mM；Tris-HCl的浓度为20 mM；Triton X-100的浓度为0.01 g/mL；三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷的浓度分别为1.4 mM；所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规碱基的酶的浓度为50 U/mL；所述具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶的浓度为320 U/mL；第一引物对的浓度为0.2 μM；第二引物对的浓度为0.8 μM。7.根据权利要求1至6中任一项所述的DNA恒温扩增方法，其中所述恒定温度为60℃～65℃中的任一温度，且所述恒定温度至少满足下列情况之一：（1）将所述反应混合物置于能够降低所述待扩增的DNA及其扩增产物的双链稳定性的温度；（2）将所述反应混合物置于能够使所述第一引物对和第二引物对与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合的温度；（3）将所述反应混合物置于能够使所述第一引物对和第二引物对与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合，并且在所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶的作用下剪切所述非常规碱基修饰区中的非常规碱基的温度，以降低所述第一引物对和第二引物对与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合的稳定性；（4）将所述反应混合物置于能够使与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合的第一引物对和第二引物对在所述DNA聚合酶的作用下延伸的温度，以产生扩增产物；和（5）将所述反应混合物置于能够使与所述待扩增的DNA及其扩增产物结合分子信标，以检测扩增产物。8.一种用于DNA恒温扩增的试剂盒，其包括：第一引物对、第二引物对、三磷酸脱氧腺苷、三磷酸脱氧鸟苷、三磷酸脱氧胞苷、三磷酸脱氧胸苷、识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基的酶和具有链置换功能的DNA聚合酶；其中所述第一引物对中的每一条引物各自包含被编码区隔开的非常规碱基修饰区和与待扩增的DNA的上游端或下游端互补的识别区，其中在所述非常规碱基修饰区中至少与编码区相邻位点处的常规DNA碱基被替换成非常规DNA碱基；所述第二引物对中的每一引物各自包含与所述第一引物对中的每一引物中的非常规碱基修饰区相同的非常规碱基修饰区；其中所述非常规碱基的数量为2-15个;优选地，所述识别并切除双链DNA中的一条链内的非常规DNA碱基酶选自DNA糖基化酶和/或核酸内切酶V；更优选地，所述DNA糖基化酶选自：胸腺嘧啶DNA糖基化酶、甲基嘌呤DNA糖基化酶、8-羟基鸟嘌呤糖基化酶1、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，及其任意组合；优选地，所述具有链置换功能的DNA聚合酶选自：Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、PyroPhage 3137 DNA聚合酶、Vent聚合...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋健晖，王海波，唐丽娟，唐昊，
申请(专利权)人：湖南融健基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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