一种抗小鹅瘟病毒的单链抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗小鹅瘟病毒的单链抗体及其制备方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用RT

【技术实现步骤摘要】
一种抗小鹅瘟病毒的单链抗体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及一种抗小鹅瘟病毒的单链抗体及其制备方法，属于基因工程


技术介绍

[0002]小鹅瘟(Goslingplague)是由小鹅瘟病毒(Goslingplaguevirus，GPV)，也称为鹅细小病毒引起的雏鹅急性或亚急性的败血性传染病。本病主要侵害4～20日龄的易感雏鹅，具有传播快、发病率高和致死率高的特点。随着雏鹅日龄增长，其发病率和致死率下降。
[0003]雏鹅卵黄抗体接种是预防、控制小鹅瘟的主要措施之一。但传统的卵黄抗体生产不仅生产成本较高、生产周期较长，而且鸡胚生产工艺还会造成较大的环保危害。
[0004]单链抗体是一种基因工程抗体，以其分子量小、特异性高、穿透力强、易于改造等特点，显示了巨大的应用潜力，越来越受到人们的重视。因此研制一种生产成本低、生产效率高的抗小鹅瘟病毒抗体的生产方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]现有技术中缺少抗小鹅瘟病毒的单链抗体及相应的高效的生产方法。
[0007][技术方案][0008]本专利技术提供了一种抗小鹅瘟病毒的单链抗体，该单链抗体能够与小鹅瘟病毒特异性结合，可用于阻断小鹅瘟病毒的感染和入侵。
[0009]所述抗小鹅瘟病毒的单链抗体，具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区VL、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区VH和位于轻链可变区VL与重链可变区VH之间的中间连接肽linker，所述中间连接肽linker为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID No.5)。所述抗小鹅瘟病毒的单链抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
[0010]本专利技术还提供一种编码上述抗小鹅瘟病毒的单链抗体的基因，其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提供一种表达上述的单链抗体的载体，所述载体为原核表达载体。优选的，所述原核表达载体为pET-28a-gpv-ScFv载体。
[0012]本专利技术还提供一种上述小鹅瘟病毒的单链抗体的制备方法，具体步骤如下：
[0013](1)采用RT-PCR直接从抗小鹅瘟病毒的单克隆细胞株的RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因；
[0014](2)利用Overlap-PCR法将连接肽linker与VH基因和VL基因相连构建单链抗体基因；
[0015](3)将步骤(2)的单链抗体基因克隆到pET-28a载体中构建重组质粒pET-28a-gpv-ScFv；
[0016](4)将步骤(3)的重组质粒pET-28a-gpv-ScFv化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，
获得能够表达抗小鹅瘟病毒的单链抗体重组菌株，利用重组菌株制备单链抗体；
[0017](5)将步骤(4)获得的单链抗体用以小鹅瘟病毒作为包被抗原进行ELISA鉴定，确定重组单链抗体的活性。
[0018]本专利技术还涉及编码所述抗小鹅瘟病毒的抗体的基因。例如，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
[0019]本专利技术还涉及携带编码所述抗小鹅瘟病毒的抗体的基因的载体或细胞。
[0020]本专利技术还涉及药物组合物，其包含药物有效量的所述的抗小鹅瘟病毒的抗体。
[0021]本专利技术的技术原理是采用RT-PCR直接从抗小鹅瘟病毒单克隆细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因。利用SOE-PCR(重组链延伸反应)法将linker与VH基因和VL基因相连构建单链抗体(ScFv)基因，并将其克隆到表达载体pET-28a中，ELISA确定抗单链抗体的活性。
[0022][有益效果][0023]单克隆抗体是针对特定抗原、特定表位的抗体，不同的抗原所对应的单克隆抗体的基因序列是不一致的，对病毒的中和能力也不一样。
[0024]本专利技术筛选到能够对小鹅瘟病毒具有中和效应的单克隆抗体，并进一步制备得到抗小鹅瘟病毒的单链抗体，该单链抗体能与小鹅瘟病毒特异性结合，GPV感染后18～42h后，采用抗小鹅瘟病毒的单链抗体处理组的病毒滴度显著低于PBS和阴性ScFv处理组(P<0.05)，说明本专利技术所涉及的ScFv具有较为显著的中和小鹅瘟病毒的活性，能够用于小鹅瘟病毒的预防和治疗。
附图说明
[0025]图1为VH-Linker-VLPCR电泳图：M为5000bp DNA ladder marker；1为阴性对照；2为VH-Linker-VL基因PCR产物。
[0026]图2为pET-28a-gpv-ScFv双酶切鉴定图；M为5000bp DNA ladder marker；1为空载质粒经BamHI和HindIII双酶切；2为重组质粒经BamHI和HindIII双酶切。
[0027]图3为抗小鹅瘟病毒单链抗体的纯化电泳图；M为预染蛋白Marker；1为纯化后的单链抗体。
[0028]图4为单链抗体对小鹅瘟病毒的体外中和效果图示。
具体实施方式
[0029]实施例1：抗小鹅瘟病毒的单链抗体的制备
[0030]1、cDNA合成：鼠源抗小鹅瘟单克隆细胞株由扬州优邦研发部制备，并保存。用Trizol法(TRIZOLReagent购自美国Invitrogen公司)提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligoprimer，根据反转录试剂盒(cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA；
[0031]2、引物设计与合成：对GenBank已公布的鼠抗体编码基因重链可变区序列和轻链可变区序列设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中VH1F分别与VH1R、VH2R用于扩增VH区；VL1F、VL2F、VL3F和VL1R用于扩增VL区；VH3F、VH3R用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F扩增的VL基因基础上加入酶切位点，VL2R用于VL基因加
入Linker序列。其中，VH3F含有BamHI酶切位点，VL2R含有HindIII酶切位点；VH3R、VL4F、VL5F、VL6F含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。Linker采用(GGGGS)3，其对应的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.18：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0032]表1
[0033][0034]3、VH和VL基因的扩增
[0035]以cDNA为模版，VH1F、VH1R为引物扩增VH基因。引物VL1F、VL2F、VL3F分别与引物VL1R配对，扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2
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PCR mix 12.5μL，模版cDNA2μL，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗小鹅瘟病毒的抗体，其特征在于，所述抗体是单链抗体，所述抗小鹅瘟病毒的单链抗体，具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区VH和位于轻链可变区VL与重链可变区VH之间的中间连接肽。2.根据权利要求1所述的一种抗小鹅瘟病毒的抗体，其特征在于，所述中间连接肽的氨基酸序列是(GGGGS)
n
，n＝1-5。3.根据权利要求1或2所述的一种抗小鹅瘟病毒的抗体，其特征在于，所述中间连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。4.根据权利要求1或3所述的一种抗小鹅瘟病毒的抗体，其特征在于，所述抗小鹅瘟病毒的单链抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。5.编码权利要求1-4任一所述抗小鹅瘟病毒的抗体的基因。6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。7.携带权利要求5或6所述基因的载体或细胞。...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁国伟，范娟，叶正琴，包菲，魏荣荣，李琛，陈林中日，潘晨，
申请(专利权)人：扬州优邦生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：