白细胞提取物中外泌体的提取方法及其在护肤品中的应用技术

提供白细胞提取物中外泌体的提取方法及其在护肤品中的应用。该提取方法包括：准备离心过滤管，该离心过滤管至少包括：一端为开口端，另一端为封闭管底的圆柱管；中心对称的伞面构造，以倒置的方式固设于所述管体内，管体的内壁上与伞状滤膜的边沿对应的位置沿周向均匀形成三个以上凸起，以能够抵住伞状滤膜的边沿，并在管体的管底的中心位置形成嵌槽，以能够与伞状滤膜的伞顶嵌合；(2)将白细胞培养上清液加入所述离心过滤管中，将该离心过滤管配置于离心机上，以离心力2000g低速离心10分钟；(3)继续以离心力10000g高速离心30分钟；(4)取出滤膜，得到白细胞提取物中外泌体。得到白细胞提取物中外泌体。得到白细胞提取物中外泌体。

【技术实现步骤摘要】
白细胞提取物中外泌体的提取方法及其在护肤品中的应用


[0001]本专利技术涉及白细胞提取物中外泌体的提取方法及其在护肤品中的应用。

技术介绍

[0002]白细胞(white blood cell，WBC)俗称白血球，是血液中非常重要的一类细胞，具有吞噬异物并产生抗体、机体损伤治愈、抗御病原体入侵等方面的能力。现有技术中对以白细胞为原料进行提取的方法主要包括裂解白细胞从而获得白细胞提取物。这种方法得到的产物中的主要成分为核苷酸并含有极其微量的细胞因子或小分子多肽，其用途主要有增强免疫力、抗炎、抗菌或抗肺纤维化。
[0003]但以核苷酸为主要成分的白细胞提取物在促进皮肤细胞增殖和新陈代谢的作用上效果并不理想。另一种方法则是从白细胞培养液中获得生长因子。生长因子是具有刺激细胞生长的活性因子，是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长和其他细胞功能的多效应的多肽类物质。现有技术表明，在化妆品中添加生长因子能够增强新陈代谢能力。当白细胞在体外扩增培养时，培养液中会产生大量的生长因子，而富含生长因子的提取物能够起到很好的促进皮肤坏死细胞和毒素的清理的作用。目前有大量研究表面，白细胞是通过外泌体这一载体而向外分泌生长因子的。
[0004]另一方面，外泌体是一种活细胞分泌，直径一般认为在40-150nm，具有双层脂质膜结构的小囊泡，它在机体内广泛存在，如外周血、腹水、尿液、唾液、脑脊液等各种体液中。目前外泌体的提取方法主要为超速离心法、超滤法、密度梯度离心法、试剂盒提取、免疫磁珠法等。其中，超速离心法和超滤法的应用较为普遍。
[0005]超速离心法分离外泌体是目前最普遍的一种方法，该方法被广泛应用于各类生物样品，如血清、血浆、细胞培养液、尿液、唾液和脑脊液等的分析，也是目前分离方法中的“金标准”，据估计，采用超速离心法的研究者占所有外泌体分离方法的56％。超速离心法大体包含4个步骤：1.低速离心去除残留细胞；2.高速离心去除细胞碎片；3.0.22μm滤膜过滤去除大直径囊泡；4.超速离心沉淀外泌体，为提高纯度可选用蔗糖密度梯度离心。但超速离心法也有操作耗时长、分离效率低、仪器昂贵等缺点。
[0006]超滤法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧，而将相对大分子物质截留在超滤膜上，以达到分离的目的。外泌体直径范围40～150nm。但超滤法的过滤膜上容易形成死细胞残体和蛋白质等多种物质的堆积，堵塞的可能性大，影响过滤效率，更会导致外泌体的粘附，从而造成损失。而且，过滤时的压力和剪切力，可能会使外泌体变形受损。

技术实现思路

[0007]本专利技术是基于以上
技术介绍
中的研究成果，并鉴于以上现有技术中存在的问题进行的研发，其目的在于提供一种简单且相对高效的白细胞提取物中外泌体的提取方法及其在护肤品中的应用。
[0008]本专利技术第一方面提供白细胞提取物中外泌体的提取方法，该提取方法包括：
[0009](1)准备离心过滤管，该离心过滤管至少包括：
[0010]管体，该管体是一端为开口端，另一端为封闭管底的圆柱管；
[0011]伞状滤膜，该伞状滤膜为中心对称的伞面构造，能够以倒置的方式固设于所述管体内，
[0012]其中，所述伞状滤膜的边沿与所述管体的内壁之间能够实现密闭配合，并在所述管体的内壁上与所述伞状滤膜的边沿对应的位置沿周向均匀形成三个以上凸起，以能够抵住所述伞状滤膜的边沿，并在所述管体的管底的中心位置形成嵌槽，以能够与所述伞状滤膜的伞顶嵌合；
[0013](2)将白细胞培养上清液加入所述离心过滤管中，将该离心过滤管配置于离心机上，以离心力2000g低速离心10分钟；
[0014](3)继续以离心力10000g高速离心30分钟；以及
[0015](4)取出滤膜，得到白细胞提取物中外泌体。
[0016]上述提取方法还包括：将人外周血进行人淋巴细胞分离液密度梯度离心得到PBMC细胞，将获得的PBMC细胞在体外进行扩增培养，离心分离得到细胞培养上清液。
[0017]上述提取方法还包括：
[0018]分离血液中的白细胞，接种于包括质量分数为5％FBS和200U的白细胞介素2的RPMI1640培养基，放置于5％的CO2培养环境下，每3～4天补充培养基，培养14天；
[0019]在白细胞培养的过程中，定期收集培养上清液，在细胞衰老前离心细胞，收集全部上清液。
[0020]优选，所述滤膜孔径为0.22μm。
[0021]优选，所述离心过滤管中所述滤膜的外壁与所述管体的管底之间的夹角在60～80度之间。
[0022]更优选地，所述滤膜的外壁与所述管体的管底之间的夹角在70～75度之间。
[0023]进一步优选地，所述滤膜的外壁与所述管体的管底之间的夹角为72.3度。
[0024]所述离心过滤管还可以t包括管盖，该管盖能够盖住所述管体的开口端，在该管盖上或在管盖与所述管体的开口端之间设有通气路径。
[0025]本专利技术另一方面提供通过上述方式提取的白细胞提取物中外泌体在护肤品中的应用。
[0026]本专利技术对于白细胞提取物中的外泌体提取简化了以往提取的步骤，并保证了较高产率。将白细胞外泌体添加至护肤品中，与提取游离细胞因子并添加到护肤品中相比，包裹在外泌体双层脂质结构中的细胞因子更容易打通细胞生物膜屏障，精准识别、定位表皮细胞损伤。
附图说明
[0027]图1是本专利技术的离心过滤管的结构示意图。
[0028]图2A是本专利技术的凸点1a与滤膜的边沿1b的卡合状态示意图。
[0029]图2B是本专利技术的嵌槽2a与滤膜的伞顶2b的嵌合状态示意图。
[0030]图3是本专利技术的数模结果示意图。
具体实施方式
[0031]下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关专利技术，而非对该专利技术的限定。在权利要求所限定的范围内本专利技术可以进行各种变形。不同的实施方式或实施例、以及常用技术手段的组合获得的新的变形等也应视为包含在本专利技术范围之内。
[0032]本专利技术在没有特别声明的情况下，数值范围“A-B”是指A以上(大于或等于A)B以下(小于或等于B)。另外，还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与专利技术相关的部分。
[0033]<外泌体的概要>
[0034]外泌体是一种由细胞分泌的细胞外颗粒。具体而言，外泌体是具有由脂质双层膜形成的泡囊结构的从细胞中释放出的直径为30nm～100nm左右的小泡。该外泌体通过被摄入至与分泌该外泌体的细胞不同的其他细胞而在分泌细胞与其他细胞之间进行信息传递是已知的。
[0035]<外泌体的稳定性>
[0036]外泌体的膜结构通常比细胞的膜结构更稳定是已知的。例如即使在-20℃的温度条件下、不添加糖类等稳定剂地对外泌体进行多次冻融处理的情况下，该外泌体中的内包物仍然被稳定地维持。而对于动物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白细胞提取物中外泌体的提取方法，其特征在于，该提取方法包括：(1)准备离心过滤管，该离心过滤管至少包括：管体，该管体是一端为开口端，另一端为封闭管底的圆柱管；伞状滤膜，该伞状滤膜为中心对称的伞面构造，能够以倒置的方式固设于所述管体内，其中，所述伞状滤膜的边沿与所述管体的内壁之间能够实现密闭配合，并在所述管体的内壁上与所述伞状滤膜的边沿对应的位置沿周向均匀形成三个以上凸起，以能够抵住所述伞状滤膜的边沿，并在所述管体的管底的中心位置形成嵌槽，以能够与所述伞状滤膜的伞顶嵌合；(2)将白细胞培养上清液加入所述离心过滤管中，将该离心过滤管配置于离心机上，以离心力2000g低速离心10分钟；(3)继续以离心力10000g高速离心30分钟；以及(4)取出滤膜，得到白细胞提取物中外泌体。2.如权利要求1所述的白细胞提取物中外泌体的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括：将人外周血进行人淋巴细胞分离液密度梯度离心得到PBMC细胞，将获得的PBMC细胞在体外进行扩增培养，离心分离得到细胞培养上清液。3.如权利要求1所述的白细胞提取物中外泌体的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括：分离血液...

【专利技术属性】
技术研发人员：周卿，
申请(专利权)人：华夏源上海生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：