本发明专利技术公开了一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法，属于微生物技术领域。本发明专利技术提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，有别于传统电泳方法(在有限可得到的细菌菌株纯培养物的范围内，识别菌株特异性序列)，本发明专利技术的方法采用群体基因组学概念，获取公共数据库几百株测序长双歧杆菌基因组信息，采用生信方法，获得置信区间更宽的“菌株特异性”序列，且节省大量时间、工作量和成本。工作量和成本。工作量和成本。
【技术实现步骤摘要】
一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法
[0001]本专利技术涉及一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法，属于微生物
技术介绍
[0002]肠道共生菌对人类健康发挥着至关重要的作用，它们中的大多数对宿主有益。双歧杆菌，被认为是宿主肠道的早期“定殖者”，被广泛证明对宿主具有健康促进作用(Frontiers in microbiology,2016,7:1204)。然而，这种益生作用背后的机制还未被阐明。许多双歧杆菌种在肠道中的丰度在不同膳食(Applied and environmental microbiology,2015,81(7):2455-2465；mBio,2017,8(1):e02348-16)、不同年龄层(Cell host&microbe,2015,17(5):690-703；BioMed Central,2014,13(S1):S4)、不同生理状态(Cell host&microbe,2014,15(3):382-392；Nature,2010,464(7285):59-65)的宿主个体间差异巨大。其中，长双歧杆菌是一个例外，它是人类肠道核心微生物组的成员(Nature,2013,493(7430):45-50)，是不同年龄阶段宿主肠道双歧杆菌属中丰度最具优势的物种(Frontiers in microbiology,2016,7:1204)，在宿主各个年龄阶段均广泛分布(Scientific reports,2018,8(1):85)，并且是少数可以在宿主肠道中稳定定殖长达数年的物种(Science,2013,341(6141))，这使得长双歧杆菌成为可代表宿主-微生物共进化的标志物种。
[0003]相比“过路菌”，具有肠道优良定殖能力的益生菌与免疫系统、宿主粘膜、上皮细胞以及土著菌群的联系更为紧密，可能发挥更优的益生功能。然而，受限于菌株水平上定量检测的技术壁垒，益生菌的肠道定殖机制一直未得到深入解析。考虑到肠道菌群中可能存在同摄入的益生菌菌株基因背景接近的种属，目前常用的平板计数和种水平PCR等定殖检测方法，均无法实现准确检测摄入益生菌定殖量的目的(Clinical Nutrition,2019,39(5),1315-1323)，因此，开发针对益生菌的菌株水平上的检测和定量方法，对于评价菌株的肠道定殖能力，继而进一步理解其益生功能性以及相关机制显得尤为必要。
[0004]目前，许多方法被用于检测益生菌在胃肠道中的存在和丰度。在研究初期，选择性培养基结合菌落鉴定方法(菌落形态学、生化方法、16S rDNA PCR,ITS-PCR，PFGE,单抗以及RAPD-PCR)被广泛使用(Applied and environmental microbiology,1999,65(11):4949-4956；Journal of Applied Microbiology,2001,90(1):43-52；Journal of pediatric gastroenterology and nutrition,2008,47(1):45-53；MSphere,2017,2(6):e00501-17；International journal of food microbiology,1995,25(2):199-203；International journal of food microbiology,1999,48(1):51-57)，但是，这些方法费时费力，并且，精度低。荧光和抗生素标记菌株或FISH方法等也具有缺陷，例如，肠道转导过程中带有荧光标记的质粒极易被菌株丢失，低的检测灵敏度以及安全因素也使得这些方法无法被广泛应用。基于16S rDNA可变区或16S-23S ITS序列的种水平PCR也被直接用于检测粪便中特定摄入益生菌的含量(BMC Research Notes,2013,6(1):252；Journal of applied microbiology,2004,96(4):777-786)，然而，该方法不能排除宿主菌群背景中基因型相似
的临近种属的干扰。
[0005]现阶段，随着细菌基因组的不断测序和积累，菌株特异性的序列开始被识别，根据这些序列对目标菌株进行检测和定量的观点开始被提出。实现菌株水平定量检测的关键是找到给定菌株的独特DNA序列。在菌株基因组大规模测序之前，专家学者根据特定的RAPD条带、来自SSH的特定DNA片段或者菌株的已知特性(LGG具有鞭毛结构，而LC705不具有)，针对一些益生菌[鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG),短双歧杆菌(Bifidobacterium breve Yakult),两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum BF-1),罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri DSM 17938),嗜酸乳杆菌(L.acidophilus LAB20),罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri DSM 16350)等]设计了一些菌株特异性引物用于菌株在肠道/粪便中的定殖量检测(Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(40):17193-17198；Journal of applied microbiology,2011,110(1):209-217；Applied and environmental microbiology,2013,79(7):2182-2188；Antonie Van Leeuwenhoek,2010,97(2):189-200,Letters in applied microbiology,2013,57(4):330-335；PLoS One,2014,9(2):e90208)。然而，这些菌株特异性DNA片段的识别是基于有限数量的菌株，使得“菌株特异性”只在比较狭窄的置信区间中有效。另外，这些方法通常需要获取各种菌株纯培养物进行大量的电泳分析，费事费力。因此，亟需找到一种操作简单、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的特异性DNA片段以实现益生菌菌株的定量检测。
技术实现思路
[0006][技术问题][0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法以实现长双歧杆菌菌株的定量检测。
[0008][技术方案][0009]为解决上述问题，本专利技术提供了一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，在对得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因进行特异性验证，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。
[0010]在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，在对得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因进行特异性验证，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。2.如权利要求1所述的一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，再以获取的长双歧杆菌菌株的基因组构建数据库，采用BlastN比对，验证得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因在核苷酸水平上的特异性，随后基于NR/NT库，通过Blast检索，验证得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因在其它种属微生物背景下的特异性，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。3.如权利要求1或2所述的一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述基因存在缺失分析使用Roary软件、Pan-Seq软件、PGAT软件或PGAP软件完成。4.如权利要求1-3任一项所述的一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1、长双歧杆菌M1-20-R01-3以及长双歧杆菌FGSZY6M4。5.一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物的方法，其特征在于，所述方法为先使用权利要求1-4任一项所述的方法获取可用于筛选和/或鉴定某一长双歧杆菌菌株的特异性基因，然后根据获取得到的特异性基因设计可用于扩增此特...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，肖越，翟齐啸，于雷雷，田丰伟，陆文伟，崔树茂，王刚，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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