一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，将生物单细胞培养液、无菌含铅溶液共同置于培养基中，密封、摇匀后进行培养，得到样本溶液；取培养后的样本溶液进行固定处理、漂洗、脱水处理、包埋切片处理，得到TEM样品。本发明专利技术成功解决了现有样品预处理方法过程复杂、使用药剂毒性强、单细胞个体内超微结构难以清晰显像的问题。难以清晰显像的问题。难以清晰显像的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种透射电镜样品的制备方法，特别是涉及一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法。

技术介绍

[0002]生物单细胞细胞结构简单，生长周期极短，研究价值极大。研究生物的分布规律有利于发掘丰富的菌种资源，推动进化，分类的研究和开发利用；研究生物与植物间的相互关系，有助于开发新的农药，生物肥料，为防止人和动物植物的病害提供理论依据；研究生物在自然界物质循环中的作用，有助于阐明地质演变和生物进化中的许多机制，为开发生物能源和促进大自然的生态平衡等提供科学的基础，因此如何借助现代科学技术方法研究微观世界变得十分重要。但是由于生物的直径单位一般为数百纳米到微米范围，且细胞结构复杂、分裂速度极快，人类肉眼难以观察。
[0003]通常，透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)是研究生物超微结构的重要工具。其分辨率可高达1-2nm，可以直接观测到大部分生物单细胞的细小结构，满足单细胞微生物的观测需求，应用范围极广。透射电镜成像是通过电子枪发出高速电子束经过1-2级聚光镜会聚后均匀照射到样品的观察区上，入射电子与样品会发生碰撞与非碰撞，由于样品很薄，大部分电子穿透样样品，其强度分布与所观察样品区的形貌、组织、结构一一对应。投射出样品的电子经过物镜、中间镜和投影镜的三级磁透镜放大投射在观察图像的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转化为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏上显出与样品形貌、组织、结构相应的图像以供使用者观察。
>[0004]TEM样品的制备是准确观察到细胞中的微观结构的重要前提。常规的超薄切片技术的制样过程比较复杂，一般包括固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤，且采用该方法制备的TEM样品，在电镜下往往难以准确区分细胞内的各细胞器位置及形态，导致失败率较高。并且，现有样品预处理方法过程复杂、使用药剂毒性强、细胞内超微结构难以清晰显像。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，可以解决现有技术制备单细胞TEM样品，失败率较高，且细胞内超微结构难以清晰显像的技术问题。
[0006]技术方案：本专利技术的一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，包括如下步骤：
[0007](1)将生物单细胞培养液、无菌含铅溶液共同置于培养基中，密封、摇匀后进行培养，得到样本溶液；
[0008](2)取培养后的样本溶液进行固定处理，漂洗；
[0009](3)将经固定处理后的样品进行脱水处理、包埋切片处理，得到TEM样品。
[0010]优选地，所述生物单细胞为藻类、细菌、真菌、放线菌、动物细胞或植物细胞。
[0011]其中，步骤(1)中，采集的生物单细胞样品的体积小于1mm3；培养基中铅离子的溶液的浓度为100-5000ppb，满足低浓度Pb对于活体藻类细胞的影响极小的原则；样本溶液的pH控制在6.8～7.2。
[0012]含铅溶液为Pb(NO3)2、PbCl2或PbSO4。
[0013]其中，步骤(2)中，固定处理包括前固定处理和后固定处理，前固定处理包括向样本溶液中加入戊二醛溶液，室温避光条件下固定3-5小时，漂洗；后固定处理包括加入锇酸，避光条件下固定1-3小时，漂洗。
[0014]步骤(3)中，TEM样品的切片厚度为60～100nm。
[0015]铅(Pb)作为一种重金属元素，会与单细胞微生物体中的大分子有机物质结合形成稳定的复合物结构，而一般细胞膜细胞器膜以及脂质大分子有机物质密度相对较大，所以易和铅离子结合形成明显的轮廓投影，便于TEM观测。
[0016]本专利技术提供一种新型透射电镜活体染色技术，将一定浓度范围内的Pb溶液作为生物单细胞透射电镜活体染色剂，在不干扰正常实验结果的情况下，提前添加于细胞培养阶段，省去了常规透射电镜样品制备方法中的醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色剂的使用。由于本专利技术方法利用的为低浓度Pb，在处理时对细胞本身产生的影响可忽略不计，并不会干扰正常的实验检测指标，因此在对其细胞形态进行TEM观测时，可以清晰地观察到单细胞个体中的各细胞器分布及其大小，大大提高了观测的成功率和结果的可靠性，同时本制样方法还简化了传统的制备流程。
[0017]有益效果：
[0018](1)本专利技术将一定浓度范围内的铅溶液作为藻类透射电镜活体染色剂，在不干扰正常实验结果的情况下，提前添加在细胞培养阶段，省去了常规透射电镜样品制备方法中的醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色剂的使用；解决了现有技术预处理样品过程复杂、使用药剂毒性强、细胞内超微结构难以清晰显像的问题，大大节省了成本。
[0019](2)本专利技术在不干扰正常实验结果观测的情况下，使用该活体染色剂，保证可清洗观察到细胞微结构的同时，可以极大地提高清晰观察切片样品的成功率。采用本专利技术进行TEM超薄切片样品的制备成功率高达90％以上，而现有技术的成功率低于30％，且不能清晰的观察到细胞微结构。
[0020](3)本专利技术可应用于不同种类的生物单细胞，如藻类(莱茵衣藻、褐藻、硅藻等)、细菌(肠杆菌)、真菌(黑曲霉、胶红酵母)及放线菌、动物细胞、植物细胞。
[0021](4)本专利技术的制备方法，在进行活体染色培养后还可以根据后续具体试验要求添加其他试剂；低浓度铅溶液不会对后续的实验研究产生影响(个别实验设计可根据需要设置预实验来验证铅离子对实验的干扰程度大小)，实验兼容性极强。
附图说明
[0022]图1为不同的制样条件下纯培养以及混合培养莱茵衣藻的TEM图；其中A-D分别为不同的制样条件；A为莱茵衣藻纯培养——铅铀染色，B为莱茵衣藻纯培养加砷处理——铅铀染色，C为莱茵衣藻加铅处理——活体染色，D为莱茵衣藻加砷和铅处理——活体染色。
[0023]图2丝状真菌黑曲霉的TEM图；A为黑曲霉细胞纯培养——铅铀染色，B黑曲霉细胞加铅处理——活体染色。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例对本专利技术进一步地详细描述。
[0025]实施例1-2、4-5中使用的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii，莱茵衣藻野生型(WT))均购于美国明尼苏达大学植物与生物生物学系衣藻资源中心；实施例3中使用的黑曲霉(NJDL 12)从大豆根际土壤中分离得到，它在中国生物菌种保藏中心的保藏号为11544。
[0026]实施例1：
[0027]用铅溶液作为活体染色剂制备莱茵衣藻透射电镜超薄切片样品的方法具体步骤：
[0028](1)活体染色：取灭菌后的250ml锥形瓶，加入100ml TAP液体培养基，用移液枪转取1mL纯化后的莱茵衣藻培养液放入培养基，再另取移液枪转移50ul浓度为1000ug/L的无菌Pb(NO3)2溶液进入培养基(培养基铅浓度500ug/L)，用无菌封口膜密封，摇匀；
[0029](2)培养：将步骤(1)接种完成后的锥形瓶，在25℃下，进行12小时光照、1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物单细胞透射电镜样品的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将生物单细胞培养液、无菌含铅溶液共同置于培养基中，密封、摇匀后进行培养，得到样本溶液；(2)取培养后的样本溶液进行固定处理，漂洗；(3)将经固定处理后的样品进行脱水处理、包埋切片处理，得到TEM样品。2.根据权利要求1所述的生物单细胞透射电镜样品的制备方法，其特征在于：所述生物单细胞为藻类、细菌、真菌、放线菌、动物细胞或植物细胞。3.根据权利要求1所述的生物单细胞透射电镜样品的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，培养基中铅离子的浓度为100-5000ppb。4.根据权利要求1所述的生物单细胞透射电镜样品的制备方法，其特征在于：步骤(1)中采集的生物单细胞样品的体积小于1mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：李真，葛滢，蒋中权，孙丹清，叶梦蕾，王妍妍，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：