用于免疫诊断和新生儿筛查的人类血液样品中表观遗传免疫细胞检测和计数的方法技术

本发明专利技术涉及表观遗传的血液和免疫细胞的检测和计数的改进方法，以及各自的用途和试剂盒。盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于免疫诊断和新生儿筛查的人类血液样品中表观遗传免疫细胞检测和计数的方法
[0001]本专利技术涉及用于人类血液样品中表观遗传血液和免疫细胞检测和计数(特别是用于免疫诊断和新生儿筛查)的方法，以及各自的用途和试剂盒。
[0002]专利技术背景
[0003]淋巴样和髓样免疫细胞亚群的定量异常指示着几种人类疾病，因此构成了诊断和患者监测的重要参数。目前，免疫细胞定量主要通过流式细胞术(FCM)进行，其提供了关于所分析的细胞类型和准确性的灵活性(1)。然而，尽管诊断实验室中使用的血液分析仪已经高度发展，并且样品物流已得到广泛应用，但FCM仍然存在固有的局限性。基于FCM的细胞计数需要新鲜的、抗凝的或保存良好的血液样品，其具有完整的白细胞。即使使用新鲜的样品，也建议快速地工作，因为分析时间可以影响结果，其中在抽血后最初几小时细胞退开始。分析时间影响结果，这是由于血液采集后几个小时内细胞退化导致的。由于生物学、技术和操作的变化，标准化仍然是一个挑战(2-5)，并且仍然需要建立标准化方案，特别是对于具有少量某些细胞群体的样品，例如在免疫缺陷中的样品(6,7)。关键的挑战是基于FCM的细胞计数需要完整的白细胞，但新鲜或保存良好的血液不能用于所有医学应用。
[0004]然而，最关键的挑战是不是所有的医学应用都保证新鲜或保存良好的血液样品的可用性，并且流式细胞仪不能在这些情况下应用。
[0005]HIV感染患者的治疗决策依赖于CD4
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T细胞计数。在低于500个CD4
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T细胞/μl血液的频率下，推荐抗逆转录病毒疗法，并且当频率低于200个细胞/μl时变得势在必行。在资源匮乏的区域中，当无法紧密连续地进行血液采集和测量时，会妨碍适当的细胞计数。因此，仅基于HIV相关的临床症状开始治疗，这可能导致次优的结果(8,9)。此外，FCM在新生儿筛查中不适用于严重的但可治疗的先天性缺陷，常规地在干燥血斑(DBS)上进行。原发性免疫缺陷(PID)构成此类先天性疾病组并且被认为是或已经是筛查程序的一部分(10)。通常，遗传缺陷导致特定白细胞亚群的定量缺乏。严重的联合免疫缺陷(SCID)代表此类PID，并且在临床上以T细胞或B细胞的缺乏为特征。目前，新生儿中SCID的检测基于定量PCR辅助T细胞受体(TREC)和免疫球蛋白κ缺失重组切除环(KREC)分析(11)。这些方法可靠地检测出缺乏近期的胸腺T细胞和骨髓B细胞迁移物，这是新生儿血液中存在的主要T细胞和B细胞亚型，即新生儿血液中存在的主要T和B细胞亚型。然而，TREC/KREC分析未能检测出严重PID中的其它特定淋巴细胞亚群缺陷(如自然杀伤(NK)细胞或嗜中性粒细胞)。尽管有这种限制，然而由于较早期的诊断，TREC新生儿筛查是有效的并且显示出改进的疾病结果(12)。新生儿分析中的TREC分析仅用于初始筛查。有疗效的造血干细胞移植之前和之后的鉴别诊断和患者监测需要技术的改变，并通过流式细胞术进行。
[0006]为了克服目前的技术和诊断局限性并扩大免疫监测的适用性，本专利技术的专利技术人建立了基于DNA(未)甲基化的免疫细胞定量评估(表观遗传qPCR)。该技术提供了可应用于新鲜、冷冻或纸斑、干血的相对和绝对免疫细胞计数。信号是数字的，即，指示每个细胞的一个正值或负值，而不是如在FCM中针对“阳性”的任意限定的阈值。它可以以自动的、与操作者无关的方式进行，并降低对试剂可变性(如抗体)的易感性。
[0007]在本专利技术的第一方面，上述目的通过用于鉴定血液免疫细胞的改进的甲基化测定的方法来实现，所述方法包括以下步骤：
[0008]a)提供人血液样品，特别是来自新生儿的人血液样品，其包含血液免疫细胞的基因组DNA；
[0009]b)用亚硫酸氢盐处理所述免疫细胞的所述基因组DNA，以将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；
[0010]c)使用合适的引物对扩增所述经处理的基因组DNA以产生扩增子，和
[0011]d)基于分析经扩增的所述扩增子来鉴定所述血液免疫细胞，
[0012]其中，所述扩增和分析包括使用选自以下的组中的至少一组的引物和探针的扩增和/或qPCR：针对CD4的SEQ ID NO 1至12、针对CD8β的SEQ ID NO 13至20、针对LRP5的SEQ ID NO 21至28、针对MVD的SEQ ID NO 29至36、针对LCN2的SEQ ID NO 37至44、针对CD3γ/δ的SEQ ID NO 45至56，以及
[0013]其中，所述扩增子中至少一个CpG位置的脱甲基化指示选自以下的至少一种血液免疫细胞：CD3
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T细胞、CD4
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T细胞、CD8
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T细胞、嗜中性粒细胞、CD14
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单核细胞、CD56
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NK细胞和CD19
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B细胞。
[0014]优选的是根据本专利技术的方法，其还包括如例如US2012-0107810中所公开的针对CD3ε的扩增子的分析。
[0015]优选的是根据本专利技术的方法，其还包括待鉴定的所述血液免疫细胞的另外的FCM。
[0016]表观遗传免疫细胞计数提供了强大的平台，其能够诊断免疫缺陷并且任选地和方便地互补了流式细胞术和T细胞受体切除环分析，然而，没有它们各自的限制。
[0017]本专利技术还涉及使用上述测定获得的甲基化数据的准确定量。这涉及几个组成部分和考虑事项：
[0018]1.内标，例如经由电脑模拟转换的质粒。
[0019]2.与特定基因的甲基化变体相反的(例如)GAPDH标准子。
[0020]3.因此，根据用1定量，将强制性脱甲基化GAPDH的所有脱甲基化拷贝与特异性(但以相同的拷贝数存在)脱甲基化基因进行比较。
[0021]4.然而，上述不允许真正的“绝对”定量，因为经由电脑模拟转换的标准品不对应于生物样品(其仅在反应小瓶中被转换)。
[0022]5.基于添加和测量所谓的GNOM(甲基化的基因组标准子)来解决4.处的问题，这里，所有原始序列等摩尔地包括在质粒中，然后进行整个过程(亚硫酸氢盐处理和纯化)。由于它们以1:1存在，因此可以在使用1中的标准品进行定量之后鉴定标准品，所述标准品显示出经由电脑模拟甲基化和原位甲基化之间的差异。使用该因子，可以校正测量的甲基化值，这显著改进了结果。
[0023]6.使用确定量的具有反转CG碱基的标准基因的核酸(质粒)，此外，可以考虑在该过程中的任何材料损失，这进一步改进了该方法。
[0024]7.为临床实践和需要而设计的可靠的和特定的测定组件。
[0025]在qPCR中扩增的细胞类型特异性DNA甲基化标志物(13-15)潜在地允许免疫细胞检测和定量，甚至在有限数量和质量的样品中。已经在前面描述了用于鉴定细胞类型特异性表观遗传标志物的基本原理(14,16-18)。用于基于DNA甲基化的免疫细胞定量的可替代
方法包括依赖于微阵列分析在全基因组范围内分析单个CpG位点(19)。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于鉴定血液免疫细胞的改进的甲基化测定的方法，其包括以下步骤：a)提供人血液样品，特别是来自新生儿的人血液样品，其包含血液免疫细胞的基因组DNA；b)用亚硫酸氢盐处理所述免疫细胞的所述基因组DNA，以将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；c)使用合适的引物对扩增所述经处理的基因组DNA以产生扩增子，和d)基于分析经扩增的所述扩增子来鉴定所述血液免疫细胞，其中，所述扩增和分析包括使用选自以下的组中的至少一组的引物和探针的扩增和/或qPCR：针对CD4的SEQ ID NO 1至12、针对CD8β的SEQ ID NO 13至20、针对LRP5的SEQ ID NO 21至28、针对MVD的SEQ ID NO 29至36、针对LCN2的SEQ ID NO 37至44、针对CD3γ/δ的SEQ ID NO 45至56，以及其中，所述扩增子中至少一个CpG位置的脱甲基化指示选自以下的至少一种血液免疫细胞：CD3
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T细胞、CD4
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T细胞、CD8
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T细胞、嗜中性粒细胞、CD14
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单核细胞、CD56
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NK细胞和CD19
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B细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其还包括对CD3ε的扩增子的甲基化状态的分析。3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括使用选自在所有待鉴定细胞中表达的基因，例如管家基因，例如GAPDH和β-肌动蛋白的脱甲基标准基因，优选使用选自针对所述GAPDH基因的SEQ ID NO 57至61的引物和探针进行分析和第一标准化。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括使用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸的第二标准化，优选使用选自针对GAP[GC]构建体的SEQ ID NO 62至64的引物和探针使用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸的第二标准化，所述经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸包含将所述至少一个脱甲基标准基因(GAP[GC]构建体)的所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括使用校准质粒的第三种标...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯文，
申请(专利权)人：精准医疗有限公司，
类型：发明
国别省市：