一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。所述工程菌的构建方法包括如下步骤：向能够产生牻牛儿基焦磷酸的受体菌株中导入烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因，得到重组菌；从所述重组菌中获得所述用于生产香叶醇和橙花醇的工程菌。本发明专利技术成功运用生物工程技术实现了香叶醇和橙花醇生物合成途径的异源重建及产物的联产，摇瓶发酵法香叶醇和橙花醇产量分别达到137.3mg/L和62.8mg/L；同时并通过重组菌株的高密度发酵技术，香叶醇和橙花醇产量分别提高约10倍。量分别提高约10倍。量分别提高约10倍。

【技术实现步骤摘要】
一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]香叶醇(又称牻牛儿醇，学名是反-3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol)与其同分异构体橙花醇(顺-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇，Nerol)均是一种非环单萜醇类化合物，是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香叶醇是玫瑰油的主要成分(约占40％～60％)，具有玫瑰花的香味，是一种名贵的香料。橙花醇具有令人愉快的玫瑰和橙花的香气，香气较平和，微带柠檬样的果香，其香气比香叶醇柔和优美，相对偏清。香叶醇和橙花醇可用于香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，还可广泛应用于药物、烟草、食品配料。此外，还可用作天然低毒防虫剂，是一类新型的化学防癌制剂。目前国内对香叶醇的年需求量超过1000吨，供不应求，缺口达上百吨。国内橙花醇的需求量也不低于500吨，也存在生产能力不足的问题。
[0003]橙花醇和香叶醇可以从天然植物中提取得到，也可通过化学方法合成。目前，大部分产品主要通过化学合成方法，是以月桂烯为原料，在催化剂的作用下与盐酸反应得到月桂烯的一级氯化物，再通过和乙酸钠反应，得乙酸香叶酯和乙酸橙花酯的混合物。然后再经过水解、蒸馏得到香叶醇和橙花醇的混合物，最后再通过精馏分别得到香叶醇和橙花醇产品。此外还可以柠檬醛为原料制备橙花醇和香叶醇，方法包括催化氢化法，醇铝法，硼氢化钠法。尹显洪采用相转移催化法对硼氢化钠法进行改进，用水和苯作混合溶剂替代纯有机溶剂，提高了反应速率。但是，化学合成法存在环境污染、条件苛刻等问题，且化学合成产物“非天然”，作为食品添加剂，消费者的认可度低，影响了产品的下游应用。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术提供了一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌及其构建方法与应用。
[0005]首先，本专利技术提供了一种用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌，宿主菌为大肠杆菌，在宿主菌中表达烟草来源的香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a，所述香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]所述宿主菌还表达牻牛儿基焦磷酸合成酶。
[0007]所述香叶醇和橙花醇合成酶TPS2a的编码基因tps2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]所述宿主菌还表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶和异戊烯焦磷酸异构酶。
[0009]第二，本专利技术还提供上述用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌的构建方法，包括以
下步骤：
[0010](1)克隆烟草香叶醇和橙花醇合成酶基因tps2a；
[0011](2)表达载体的构建：将橙花醇合成酶基因tps2a连接到pYJM26质粒的BglII和XhoI双酶切位点之间，得到重组质粒pT2a；
[0012](3)重组菌转化：将pYJM14质粒与步骤(2)所得重组质粒pT2a转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌。
[0013]步骤(1)具体为：提取烟草叶片组织的RNA，采用逆转录酶将RNA转化为cDNA模板，以逆转录反应得到的cDNA为模板，正向引物为：5'-ATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3'，反向引物为：5'-TTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3'，进行PCR扩增；凝胶电泳回收片段大小为1854bp的目的基因tps2a。
[0014]步骤(2)具体为：将橙花醇合成酶基因tps2a进行TA克隆，连接到克隆载体中，得到重组质粒pEASY-T2a；以重组质粒pEASY-T2a为模版，采用正向引物T2a-F(5'-GAAGATCTATGGCCACCTCCATAAGACCTGCAA-3')和反向引物T2a-R(5'-CCCTCGAGTTATAGGGATGGATTGGGAGTCAAT-3')进行PCR扩增，凝胶电泳回收片段大小约为1870bp的目的基因片段；将所得目的基因片段与pYJM26质粒分别用BglII和XhoI进行双酶切，回收分别得到外源基因片段和载体片段，将载体与外源片段按摩尔比1:5的比例进行连接，得到重组质粒pT2b。
[0015]所述pYJM26质粒，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2质粒，是携带有来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE，GenBankNo.AAG02438)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS，GenBank No.AAG02439)；以及来源于北美冷杉(Abies grandis)的牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GPPS2，GenBankNo.AF513112.1)的pACYCDuet-1。pYJM26的构建方法参见Yang J,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。
[0016]所述pYJM14质粒，即pTrc-low质粒，是携带有来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12，GenBankNo.NM_001182715.1)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8，GenBankNO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBank NO.X97557.1)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B。该质粒的构建方法参见Yang J,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。
[0017]第三，本专利技术还提供了上述用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌在发酵联产香叶醇和橙花醇中的应用。
[0018]上述应用具体为：将构建的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌接种于一级种子培养基中，培养为一级种子液，一级种子液接种于二级种子培养基中，培养为二级种子液，二级种子液接种于发酵培养基中，发酵培养。
[0019]所述一级种子培养基为LB液体培养基(或称LB种子培养基)，一级种子液的培养温度为37℃，培养时间为8-12h。
[0020]所述一级种子培养基和二级种子培养基中均含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉
素和终浓度为34μg/mL的氯霉素。
[0021]所述二级种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO.NM_001182727.1)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19，GenBank NO.X97557.1)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1，GenBank NO.NM_001183931.1)的pTrcHis2B。9.一种权利要求1-3任一项所述的用于联产香叶醇和橙花醇的工程菌在发酵联产香...

【专利技术属性】
技术研发人员：李依婷，张汝兵，刘炜，咸漠，杨爱国，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：