一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法技术

一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法，包括下列步骤：步骤1：对含有NovQ表达菌株的菌液进行超声波处理，然后离心收集上清液得到细胞破碎液；步骤2：将第一反应底物、第二反应底物、MgCl2和细胞破碎液混合得到反应体系；所述第一反应底物为甲萘醌和甲萘醌氢醌中的至少一种，所述第二反应底物是异戊二烯焦磷酸和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸中的至少一种；步骤3：将反应体系置于氮气气氛下，然后在20

【技术实现步骤摘要】
一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法


[0001]本专利技术属于维生素制备
，涉及一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法。

技术介绍

[0002]芳香族异戊烯基转移酶是异戊烯基活性化合物合成过程中的关键酶，主要催化异戊烯基焦磷酸基团的脱除以及与底物的连接反应，在功能产品的开发等领域有着广泛的应用。根据细胞中存在形式的不同，芳香族异戊烯基转移酶可以分为膜结合型和可溶型两种。其中膜结合型异戊烯基转移酶是一种依托于生物膜而起作用的酶，它们的三维结构中一般存在多个跨膜结构域，经过复杂的折叠过程形成具有活性的酶分子，而可溶型异戊烯基转移酶则不依赖于膜结构，可以催化异戊烯基侧链和芳香主环之间的亲电取代反应，形成C-C共价键。常见的功能性芳香族异戊烯基转移酶包括雪白色链霉菌来源的NovQ和人源的UBIAD1等。
[0003]维生素K2又名甲萘醌类化合物，它的萘醌环上3号位经异戊烯基转移酶的催化连接侧链，根据侧链重复的数目n（1~14）可以将维生素K2命名为MK-n。在临床上，维生素K2主要用来促进凝血和预防骨质疏松，近年来又陆续发现其在抗击肿瘤和预防帕金森症等方面有辅助作用。维生素K2的合成方法主要有化学合成法和微生物合成法两种。其中化学合成法主要包括付克烷基化法、侧链延长法和环戊二烯加成法等，该法具有催化条件严苛，原材料昂贵且副产物多等劣势，现阶段很难符合维生素K2大规模生产的需求。微生物合成法则是利用微生物菌种生产维生素K2，常见的菌种包括枯草芽孢杆菌、黄杆菌和肠道微生物等，但该法的代谢路径复杂，受控因素较多，合成效率整体不高。
[0004]为了直观判断异戊烯基转移酶的催化能力和效率，进而减少代谢阻遏和竞争性底物消耗等干扰因素的影响，可以采用体外催化法来实现。体外催化是利用工程微生物生产具有生物活性的酶分子，在体外营造酶催化的最适条件，进而获得催化产物的过程。
[0005]利用异戊烯基转移酶制备维生素K2国内外鲜有报道。李哲敏等人在毕赤酵母中表达了异戊烯基转移酶NovQ，经过体外实验发现其可以利用甲萘醌氢醌合成维生素K2；孙小雯等人异源表达了膜结合型HsUBIAD1，在最佳的催化条件（pH 7，31℃）下，该酶可以合成MK-4，活力是初始状态的2.3倍。由于胞外催化是在微生物发酵法的基础上建立起来的，该法具有多种不可替代的优势，越来越受到人们的关注。维生素K2的合成未来可能会以体外催化为基础，构建无细胞催化体系，结合酶分子改造手段，高效获取产物维生素K2。
[0006]胞外催化制备维生素K2可以忽略细胞中很多的干扰因素如代谢阻遏和竞争性底物消耗等，进而直观判断异戊烯基转移酶的活性和效率，也可以以异戊烯基转移酶为基础，进行无细胞代谢通路设计，为最终产业化合成维生素K2及其类似物提供理论基础和实践经验。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法，包括下列步骤：步骤1：对含有NovQ表达菌株的菌液进行超声波处理，然后离心收集上清液得到细胞破碎液；步骤2： 将第一反应底物、第二反应底物、MgCl2和细胞破碎液混合得到反应体系；所述第一反应底物为甲萘醌和甲萘醌氢醌中的至少一种，所述第二反应底物是异戊二烯焦磷酸和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸中的至少一种；步骤3：将反应体系置于氮气气氛下，然后在20-40℃条件下进行反应，反应结束后，将反应液冻干，然后用甲醇萃取，萃取液离心后取上清液，上清液即含有纯化的维生素K2。
[0009]优选的技术方案为：反应体系中，甲萘醌的浓度为0.25-0.75mM。
[0010]优选的技术方案为：反应体系中，甲萘醌氢醌的浓度为0.2-1mM。
[0011]优选的技术方案为：反应体系中，异戊二烯焦磷酸浓度为0.2-0.3mM。
[0012]优选的技术方案为：反应体系中，牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸浓度为0.3-0.6mM。
[0013]优选的技术方案为：反应体系中，MgCl2的浓度范围为2-3mM。
[0014]由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有的优点是：1、本专利技术利用细胞破碎液实现了体外催化合成维生素K2，该法操作简单，排除了全细胞催化过程中的竞争性抑制等不利因素。
[0015]2、本专利技术将体外催化思路应用于膜结合型异戊烯基转移酶，实现了粗酶液合成维生素K2的构想。
具体实施方式
[0016]以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效。
[0017]实施例1：一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法（1）异戊烯基转移酶的分离提取异戊烯基转移酶（简称NovQ），由大肠杆菌异源表达，经分离提取制得。
[0018]NovQ的获取：从NCBI中查到novQ的全序列，设计引物如下：R1：5-GGAATTCCATATGCCCGCACTCCCGATG-3。
[0019]R2：5-GGGGTACCTCAATGATGATGATGATGATGTCGGGCACCTCCGGTGAT-3。
[0020]利用R1和R2为引物，以雪白色链霉菌基因组为模板进行PCR扩增。PCR体系如下：1 μL质粒，分别加入10 μM引物各1 μL，12.5 μL PCR Mix，最后加ddH2O补齐至25 μL。扩增的参数为94℃变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延长80 s，32个循环，72℃延长10min，。经PCR纯化试剂盒纯化后得到目的基因片段，NdeI/KpnI双酶切后连接至质粒pETDuet-1的多克隆位点1中，得到质粒pETDuet-novQ。采用热激法将表达质粒pETDuet-novQ转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，使用氨苄青霉素浓度100μg/mL的抗性平板进行筛选，经过菌液PCR验证得到表达菌株BL21(DE3)-pETDuet-novQ。菌液PCR体系如下：1 μL菌液，分别
加入10 μM引物各1 μL，12.5 μL PCR Mix，最后加ddH2O补齐至25 μL。扩增的参数为94℃变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延长80 s，25个循环，72℃延长10 min，将阳性克隆测序验证，得到NovQ表达菌株。
[0021]取500μL NovQ表达菌株的菌液，接种至50mL LB培养基中，待菌液OD
600
达到0.6-0.8左右时添加诱导剂IPTG，终浓度为0.5mM。在20℃条件下培养6h，然后8000rpm下离心20min，收集菌体，沉淀用PBS缓冲液洗涤3次，并加入10mL PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎细胞，超声功率为20%，超声模式为工作5s停止5s，超声时间为2-4min。12000rpm下离心30min，收集上清液。细胞破碎液的获取，纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：对含有NovQ表达菌株的菌液进行超声波处理，然后离心收集上清液得到细胞破碎液；步骤2： 将第一反应底物、第二反应底物、MgCl2和细胞破碎液混合得到反应体系；所述第一反应底物为甲萘醌和甲萘醌氢醌中的至少一种，所述第二反应底物是异戊二烯焦磷酸和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸中的至少一种；步骤3：将反应体系置于氮气气氛下，然后在20-40℃条件下进行反应，反应结束后，将反应液冻干，然后用甲醇萃取，萃取液离心后取上清液，上清液即含有纯化的维生素K2。2.根据权利要求1所述的异戊烯基转移酶胞外催化制备维生素K2的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑之明，倪文枫，赵根海，王鹏，王丽，孙小雯，蒋春旭，张梦雪，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：