一种通过指尖血评估生育力相关基因的检测方法及系统技术方案

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种通过指尖血评估生育力的基因检测方法及其应用。所述的检测方法包括：获取指尖血样，采用磁珠法抽提干血斑核酸；构建文库并质控分析插入片段分布情况；根据生育力相关基因设计探针，测序数据获得后，对数据进行质控和低质量过滤，与人类参考基因组比对并进行SNP分型；通过常用数据库和/或工具对变异进行注释；通过与公共数据库以及自有数据库比对，集成LIMS系统从而形成检测分析报告；使用流程跟踪模块跟踪每一个检测步骤直至形成检测报告。本发明专利技术还包括相应的检测系统。本发明专利技术的检测方法和系统检测全面、结果准确、科学专业，能够用于查明不孕不育遗传学病因，指导辅助生殖方案。指导辅助生殖方案。指导辅助生殖方案。

【技术实现步骤摘要】
一种通过指尖血评估生育力相关基因的检测方法及系统


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及基因检测方法，尤其涉及一种通过指尖血评估生育力相关基因的检测方法、系统及其应用。

技术介绍

[0002]根据世界卫生组织的规定，育龄的夫妇在有规律的性生活的情况下，没有采取任何避孕措施，超过1年不怀孕属于不孕不育症。
[0003]不孕不育的原因多种多样。因男性原因导致配偶不孕者，称男性不孕症或男性不育症，习惯称男性不育。男性不育的原因主要有：(1)精子数量不足：正常男子每毫升精液能产生至少2千万个精子，如果少于2千万个精子则为数量不足。(2)精子活力不足：快速向前精子少于25％。(3)精子形态不良：畸形精子大于70％。(4)无精子或精子完全缺乏：睾丸功能衰竭、输精管堵塞及双侧输精管缺如。(5)性功能障碍：射精障碍或阳痿。(6)死精子症、逆行射精及血精子症。(7)内分泌功能异常，等等。女性的原因主要有：(1)输卵管因素：输卵管受损或阻塞，阻碍了卵子与精子的遇合。(2)卵巢因素：排卵异常或各种卵巢肿瘤性病变。(3)宫颈因素：子宫颈发育及腺体分泌不良或子宫颈各种炎症及肿瘤。(4) 子宫因素：先天发育不良、畸形、子宫肿瘤及子宫内膜异位症。(5)子宫内膜增殖症、子宫内膜炎症及粘膜下肿瘤，等等。出现上述症状的原因很多。
[0004]目前医院针对不孕不育症患者的检测项目很多也很专业，例如通过采集静脉血来操作必须由专业人员操作完成，且必须去医疗机构进行血样采集。很多患者碍于情面或者工作繁忙，不愿意去医疗结构参加不孕不育相关的门诊，但是所谓“不孝有三，无后为大”，长期处于备孕状态的育龄夫妇不仅需要面对自我疑惑，更要承受来自长辈、社会的质疑。
[0005]但是，到目前为止，尚未有关于帮助育龄夫妇了解不孕不育原因的快捷检测方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种通过指尖血评估生育力相关基因的检测方法，旨在通过采集受检者指尖血，用特定采样盒制作成血斑，从待测样本中提取遗传物质DNA，通过探针杂交捕获的方法，捕获中国人群常见生育率相关基因的外显子以及UTR
±
10bp以内的区域，并进行高通量测序，以检测相关基因的突变情况。
[0007]本专利技术提供了一种通过指尖血评估生育力相关基因的检测方法，所述的检测方法包括：
[0008]获取指尖血样，所述的指尖血样包括至少一个由20-50微升血样形成的干血斑；
[0009]采用磁珠法抽提干血斑核酸；
[0010]对所抽提DNA进行定量、打断并构建文库，对所构建文库质控分析插入片段分布情况，插入片段成正态分布，峰值在320bp-380bp之间；
[0011]使用识别生育力相关基因的探针进行检测，所述的探针的覆盖度不小于95％；
[0012]测序数据获得后，对数据进行质控和低质量过滤，与人类参考基因组比对，并进行
SNP 分型；
[0013]通过常用数据库和/或工具对变异进行注释，通过与公共数据库以及自有数据库比对，集成公司自有实验室管理系统(LIMS系统)，形成检测分析报告。
[0014]使用流程跟踪模块跟踪每一个步骤直至形成检测报告。
[0015]较好的，所述的获取指尖血样是在非医疗机构，使用采血针自行获取20-50微升血样。
[0016]针对本专利技术的不孕不育相关检测，采用指尖血采样的优势包括：
[0017]采集简便：可随时随地取样；
[0018]采样量少：仅需微量的指尖血；
[0019]运输方便：干血斑便于保存和运输；
[0020]不易降解：可保持样本生物稳定性。
[0021]较好的，所述使用磁珠抽提干血斑中核酸的步骤包括：
[0022]样品溶解和消化：将负载干血斑的滤纸剪成小片，放入离心管，加入细胞裂解液和蛋白酶K溶液，涡旋混匀，60℃加热裂解40-55min；
[0023]样品裂解：在离心管中再加入裂解液2，金属浴加热裂解，每5min摇晃混匀一次；
[0024]移至新管：高速离心后，转移全部上清至新的离心管中；
[0025]核酸结合：向离心管中加入异丙醇和磁珠悬浮液，涡旋振荡后静置；
[0026]注意事项：1)每次吸取磁珠悬浮液前尽量摇晃均匀；2)混匀不充分可能导致得量降低。
[0027]磁性分离：将离心管置于磁力架上静置直至磁珠吸附完全，保持离心管固定于磁力架上，完全弃去上清液。
[0028]清洗I：向离心管中加入清洗液1，将离心管从磁力架上取下，吹散磁珠后涡旋震荡并磁性分离。
[0029]清洗II：使用清洗液2(已加入无水乙醇)，参照上述操作2次，弃尽上清。
[0030]除醇：将弃尽上清液后的离心管置于磁力架上，连同磁力架一起放入干燥箱中，干燥至无明显乙醇气味。用无水乙醇漂洗一遍，可以提高除醇的效率。
[0031]洗脱：取出离心管，加入洗脱液，吹打使磁珠与洗脱液充分混匀，将离心管置于金属浴上热洗脱，确保磁珠与核酸洗脱完全。
[0032]核酸转移：洗脱完毕后，将离心管置于磁力架上静置至磁珠吸附完全，将洗脱液转移至另一干净离心管中，保存备用。
[0033]所述的磁珠为功能性磁性纳米生物材料，表面修饰有特殊化学基团，具有独特的核酸分离作用，配合特殊缓冲液系统，在一定条件下对核酸具有极强的特异性亲和力，当条件改变时磁珠会可逆的释放核酸，从而达到快速分离纯化核酸的目的，并最大限度的去除蛋白质及其它杂质，从而获得高质量的核酸产物，整个操作过程简单、快速且高效。
[0034]较好的，所述的构建文库包括以下步骤：
[0035]S1、对基因组DNA片段进行末端修复，并在3
’
端加“A”；
[0036]S2、连接接头并且纯化基因组DNA片段；
[0037]S3、文库预扩增；
[0038]S4、探针过夜杂交，所述的探针包含是识别生育力相关基因的核酸。
[0039]所述的生育力相关基因选自269个基因。
[0040]本申请适用人群包括：
[0041]男性：
[0042]有明确临床表现的男性不育症人群，患有男性少精、弱精、精子畸形、无精子症人群，患有男性不育伴隐睾症人群，不明原因的男性不育症患者，妻子有不明原因不孕不育史的男性人群，想了解自己生育力别的男性人群，等等。
[0043]女性：
[0044]有明确临床表现的不孕不育症的女性，无明确原因发生死胎、自然流产或胎停育的女性，有不良孕产史的女性，如习惯性流产、死胎、死产等，试管婴儿多次不明原因失败的女性，不明原因的女性不孕不育人群，想了解自己生育力别的女性人群，等等。
[0045]较好的，所述的使用识别生育力相关基因的探针进行检测包括以下步骤：
[0046]磁珠与识别生育力相关基因的探针结合；
[0047]将结合有识别生育力相关基因的探针的磁珠与构建的文库孵育，漂洗以去除非特异结合的文库。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过指尖血评估生育力相关基因的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：获取指尖血样，所述的指尖血样包括至少一个由20-50微升血样形成的干血斑；采用磁珠法抽提干血斑核酸；对所抽提的核酸进行定量、打断并构建文库，对所构建文库质控分析插入片段分布情况，所述的插入片段呈正态分布，峰值在320bp-380bp之间；使用识别生育力相关基因的探针进行检测，所述的探针的覆盖度不小于100％；测序数据获得后，对数据进行质控和低质量过滤，与人类参考基因组比对并进行SNP分型；通过常用数据库和/或工具对变异进行注释，与公共数据库以及自有数据库进行比对，形成检测分析报告；使用流程跟踪模块跟踪每一个检测步骤直至形成检测报告。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的获取指尖血样是使用采血针获取20-50微升血样。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的构建文库包括以下步骤：S1、对基因组DNA片段进行末端修复，并在3
’
端添加腺嘌呤核糖核苷酸；S2、连接基因组DNA片段的接头并且纯化基因组DNA片段；S3、文库预扩增；S4、探针过夜杂交，所述的探针包含识别生育力相关基因的核酸。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的使用识别生育力相关基因的探针进行检测包括以下步骤：磁珠与识别生育力相关基因的探针结合；将结合有识别生育力相关基因的探针的磁珠与构建的文库孵育，漂洗以去除非特异结合的文库。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的人类参考基因组是hg19基因组。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的方法中，使用fastp软件对数据进行质控和低质量过滤，通过BWA-mem算法进行人类参考基因组比对，通过GATK软件进行SNP分型。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法中，通过Clinvar、OMIM和/或HGMD数据库对变异进行注释。8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，变异致病性判读参考为美国医学遗传学与基因组学学会指南，对于单个变异位点的判读包括搜集致病性证据和良性证据，以及根据所获得的证据，按照美国医学遗传学与基因组学学会指南对位点的致病性做出分类；所述的致病性证据和/或良性证据包括极强的致病证据、强烈的致病证据、较强的致病证据、支持致病证据、极强的良性证据、强力良性证据和/或支持良性证据，变异的种类包括已知致病变异、疑似致病变异、已知良性变异、疑似良性变异和/或临床意义未明变异；判定标准包括但不限于：
公共数据库包含ExAC、1000G、EVS数据库，变异通过其在对照人群或自然人群中的频率评估变异的致病性；患者表型是否与基因变异的临床特征是否一致；遗传模式参考OMIM的Inheritance；文献致病性查询所使用的搜索引擎包括Clinvar数据库、HGMD数据库、谷歌学术搜索；和/或计算机预测软件，所述的使用计算机预测软件判断包括但不限于：使用fastp软件对数...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚航，陈家生，
申请(专利权)人：和卓生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：