用于核酸检测的组合物和方法技术

本发明专利技术公开用于核酸检测的组合物和方法。本发明专利技术基于环介导等温扩增结合金磁微粒层析系统实现快速分子诊断，包括基于单位点SNP及病原微生物核酸检测。本发明专利技术成功引入防污染系统并通过双标记产物实现与纳米金磁微粒结合，进而快速实现核酸检测。本发明专利技术可实现多样本类型及核酸免提取，且无需大型设备，操作简单便捷，整个过程仅需约30分钟，可实现目视化检测或磁定量检测。或磁定量检测。或磁定量检测。

【技术实现步骤摘要】
用于核酸检测的组合物和方法


[0001]本专利技术涉及快速核酸检测领域，具体地涉及一种基于环介导等温扩增(LAMP)结合金磁微粒层析系统实现快速分子诊断，特别是基于单位点SNP及病原微生物的核酸检测。

技术介绍

[0002]传统的酶切方法、DNA芯片杂交、质谱技术以及荧光定PCR等方法，均已被用来检测SNP或病原微生物，但这些方法仍受限于昂贵的设备投入、复杂的操作和专业人员的培训，并不适合于大多数临床医院在常规临床检验中的推广使用。传统的聚合酶链式反应也需要昂贵热循环仪器，需要多个不同的热循环步骤等多种操作，时间长，限制了现场检测的应用。
[0003]相对于传统的核酸检测技术，基于环介导等温扩增(LAMP，Loop-Mediated Isothermal Amplification)技术是一种核酸扩增新方法，针对目标基因的6个或8个区域设计4种或6种引物，在特定酶的作用下以恒定温度进行反应。该技术不需要昂贵仪器，而且反应速度快，具有高特异性和扩增速率，节省了变温过程所耗费的时间、且不需要升降温反复循环，就可实现指数扩增。
[0004]目前已公开了许多基于LAMP对微生物进行检测的方法。例如，CN108034700A公开了一种由分子信标介导并结合核酸层析检测技术的等温扩增检测方法及其应用。该方法能用于检测多种生物流体介质中的病原体基因组，如血小板中多种未知的污染菌或经输血传播的微小巴贝西虫。该技术将分子信标介导的等温扩增产物用核酸层析方法进行检测，增强了等温扩增技术向即时检验方向转化开发的可能。
>[0005]然而，目前的研究并没有开发用于对SNP基因及病原微生物核酸进行快速基因分型的检测技术。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于LAMP-金磁微粒层析的核酸检测技术，能够快速、准确地进行检测核酸，特别适用于SNP基因分型以及病原微生物的快速检出。具体地，本申请包括以下内容。
[0007]本专利技术的第一方面，提供一种用于核酸检测的组合物，其包括用于等温扩增核酸的LAMP系统和用于显示扩增结果的层析系统，其中：所述LAMP系统包括两条外引物和两条内引物，且在至少一条内引物上标记有能够与金磁颗粒结合的结合分子；所述层析系统包括金磁颗粒和层析介质。
[0008]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，所述核酸检测是指检测核酸的SNP单位点信息，所述LAMP系统进一步包括环引物，且所述环引物的互补序列位于所述内引物互补序列的下游，所述内引物包括野生型特异性引物和突变型特异性引物，在所述野生型特异性引物和所述突变型特异性引物的5
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端分别标记生物素，且在所述环引物5
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端标记地高辛；或者在所述野生型特异性引物和所述突变型特异性引物的5
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端分别标记地高
辛，且在所述环引物5
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端标记生物素。
[0009]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，在所述野生型特异性引物和所述突变型特异性引物内分别引入错配碱基，从而增强特异性。
[0010]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，所述错配碱基的数量为1-3，且位于SNP单位点的上游或下游，并与SNP位点相临。
[0011]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，所述外引物的序列选自SEQ ID NO:1-2、8-9所示的序列，所述内引物的序列选自SEQ ID NO:3-6、10-13所示的序列，和所述环引物的序列选自SEQ ID NO:7和14所示的序列。
[0012]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，其进一步包括防污染系统，所述防污染系统只需使所述LAMP系统在25℃～40℃下孵育即可消除由空气引进入到系统的污染。
[0013]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，所述核酸检测是指针对病原微生物的检测，此时两条内引物分别标记不同的结合分子，例如生物素或地高辛。
[0014]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，所述外引物的序列选自SEQ ID NO:15-16、19-20、23-24、27-28所示的序列，所述内引物的序列选自SEQ ID NO:17-18、21-22、25-26、29-30所示的序列。
[0015]根据本专利技术所述的用于核酸检测的组合物，优选地，所述金磁颗粒的表面偶联有地高辛抗体，且所述层析介质上标记链霉亲和素分子。
[0016]本专利技术的第二方面，提供一种用于核酸检测的方法，其包括使用根据第一方面所述的组合物的步骤。
[0017]本专利技术的快速核酸检测技术基于环介导等温扩增技术，并结合金磁微粒层析系统来实现快速分子诊断，包括基于单位点SNP及病原微生物核酸检测。该技术通过双标记产物实现与纳米金磁微粒结合，进而实现基因快速分型，检测样本类型包括基因组DNA样、全血样本、口腔拭子及鼻咽拭子样本以及唾液样本。该技术免去DNA提取纯化步骤，无需大型设备，操作简单便捷，整个过程仅需约30分钟。
附图说明
[0018]图1为一种示例性免疫层析试纸条结构图。
[0019]图2为实施例1的基因分型检测的三种结果：TT为纯合突变型(677TT型)，CC为野生型(677CC型)，CT为杂合突变性(677CT型)。
[0020]图3为实施例2的检测结果：左图为SARS-CoV-2病毒ORF位点的检测结果，阳性表示该检测者为SARS-CoV-2病毒携带者，阴性则表示该检测者并非SARS-CoV-2病毒携带者；右图为SARS-CoV-2病毒N蛋白的检测结果，阳性与阴性的判读与上述结果一致。
[0021]图4为一种示例性磁定量检测结果。C线上的磁信号峰值表明该系统正常，T线上的磁信号峰值结合C线上的磁信号可以判读该样本基因型。
[0022]图5为一种示例性单位点SNP的多样本的实施例1检测结果。根据基因型检测结果，此人为MTHFR C677T的纯合野生型。
[0023]图6为一种示例性病原微生物实施例2的检测结果。根据检测结果显示，此病毒为SARS-CoV-2病毒。
[0024]附图标记说明如下：
[0025]1-样品垫，2-结合垫，3-免疫层析膜，4-支撑板，5-吸水纸。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。
[0027]本专利技术的核酸检测技术包括但不限于用于核酸检测的组合物以及用于核酸检测的方法。只要核酸检测基于环介导等温扩增，并结合金磁微粒层析即在本专利技术的范围之内。下面详细说明本专利技术的核酸检测技术。
[0028][用于核酸检测的组合物][0029]本专利技术的第一方面，提供用于核酸检测的组合物，其包括用于等温扩增核酸的LAMP系统和用于显示扩增结果的层析系统。
[0030]用于等温扩增核酸的LAMP系统
[0031]本专利技术中，用于等温扩增核酸的LAMP系统有时简称“L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸检测的组合物，其特征在于，包括用于等温扩增核酸的LAMP系统和用于显示扩增结果的层析系统，其中：所述LAMP系统包括两条外引物和两条内引物，且在至少一条内引物上标记有能够与金磁颗粒结合的结合分子；所述层析系统包括金磁颗粒和层析介质。2.根据权利要求1所述的用于核酸检测的组合物，其特征在于，所述核酸检测是指检测核酸的SNP单位点信息，所述LAMP系统进一步包括环引物，且所述环引物的互补序列位于所述内引物互补序列的下游，所述内引物包括野生型特异性引物和突变型特异性引物；在所述野生型特异性引物和所述突变型特异性引物的5
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端分别标记生物素，且在所述环引物5
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端标记地高辛，或者在所述野生型特异性引物和所述突变型特异性引物的5
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端分别标记地高辛，且在所述环引物5
’
端标记生物素。3.根据权利要求2所述的用于核酸检测的组合物，其特征在于，在所述野生型特异性引物和所述突变型特异性引物内分别引入错配碱基，从而增强特异性。4.根据权利要求3所述的用于核酸检测的组合物，其特征在于，所述错配碱基的数量为1-3，且位于SNP单位点的上游或下游。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：惠文利，崔亚丽，梁建萍，黄晓娟，董晨，朱娟莉，刘枭男，
申请(专利权)人：西安金磁纳米生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：