本发明专利技术涉及通过对一个或多个序列标签进行多重扩增，并将所述序列标签附接至靶核酸和/或其拷贝，然后对所述扩增产物进行高通量测序，从而执对核酸群体进行基于序列的分析。在一些实施例中，本发明专利技术包括以下连续步骤：延伸引物、去除未延伸的引物和添加新的引物用于扩增(例如通过PCR)或用于额外的引物延伸。本发明专利技术的一些实施例涉及对接受癌症治疗的患者进行微小残留病灶(MRD)分析。将序列标签引入序列读段为测定克隆型提供了有效方法，同时为检测来自同一患者的其他样本的遗留污染或来自曾在同一实验室中曾检测的其他患者的样本的遗留污染提供了一种便利方法。的遗留污染提供了一种便利方法。的遗留污染提供了一种便利方法。
【技术实现步骤摘要】
用序列标签进行大规模生物分子分析
[0001]本申请是申请日为2014年6月30日、申请号为2014800481194、专利技术 名称为“用序列标签进行大规模生物分子分析”的专利技术专利申请的分案申 请。
[0002]交叉引用
[0003]本专利申请要求于2013年7月1日提交的美国临时专利申请No. 61/841,878以及于2014年5月21日提交的美国临时专利申请No. 62/001,580的优先权，两者均以引用方式全文并入本文。
[0004]序列表
[0005]本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交并且据 此全文引入以供参考。所述ASCII副本创建于2014年6月27日，名称为 848US00-SL-ST25.txt，文件大小为2千字节。没有添加新客体。
技术介绍
[0006]由于大规模DNA测序的速度和便利性提高，并且其每个碱基的成本降 低，所以大规模DNA测序在诊断和预后中的应用迅速扩展，例如Ding etal,Nature,481(7382):506-510(2012)(Ding等人，《自然》，2012年，第 481卷，第7382期，第506-510页)；Chiu et al,Brit.Med.J.,342:c7401 (2011)(Chiu等人，《英国医学期刊》，2011年，第342卷，第c7401 页)；Ku et al,Annals of Neurology,71(1):5-14(2012)(Ku等人，《神经学 年鉴》，2012年，第71卷，第1期，第5-14页)等等。具体地讲，编码 免疫分子(如T细胞或B细胞受体，或者它们的组分)的核酸谱包含大量 有关生物体健康状态或疾病的信息，因而已提出将此类谱用作多种病症的 诊断或预后指标，例如Faham and Willis,U.S.patents 8,236,503and 8,628927 (Faham和Willis，美国专利8,236,503和8,628927)；Freeman et al, Genome Research,19:1817-1824(2009)(Freeman等人，《基因组研究》，2009年，第19卷，第1817-1824页)；Han et al,J.Immunol.,182(1001): 42.6(2009)(Han等人，《免疫学杂志》，2009年，第182卷，第1001 期，第42.6页)；Boyd et al,Sci.Transl Med.,1(12):12ra23(2009)(Boyd等 人，《科学转化医学》，2009年，第1卷，第12期，第12-23页)；He etal,Oncotarget(March 8,2011)(He等人，《肿瘤标靶》，2011年3月8 日)。
[0007]举例来说，许多经治疗的癌症患者常常留有与癌症有关的微小残留病 灶(MRD)。也就是说，即使可通过临床措施使患者的疾病响应治疗而得以 完全缓解，但由于这样或那样的原因，一小部分癌细胞可能未被消灭而保 留下来。对于患者的继续治疗而言，这种残留群体的类型和大小是重要的 预后因子，例如Campana,Hematol.Oncol.Clin.North Am.,23(5):1083-1098 (2009)(Campana，《北美血液学与肿瘤学临床》，2009年，第23卷，第 5期，第1083-1098页)；Buccisano et al,Blood,119(2):332-341(2012) (Buccisano等人，《血液》，2012年，第119卷，第2期，第332-341 页)。因此，人们已开发了若干用于评估这种群体的技术，包括基于流式 细胞术、原位杂交、细胞遗传学、核酸标记扩增等的技术，例如Buccisanoet al,Current Opinion in Oncology,21:582-588(2009)(Buccisano等人，《肿 瘤学新见》，2009年，第21卷，第582-588页)；van Dongen et al, Leukemia,17(12):
2257-2317(2003)(van Dongen等人，《白血病》，2003 年，第17卷，第12期，第2257-2317页)等等。从T细胞和/或B细胞扩 增编码免疫受体(即克隆型)区段的重组核酸，对于评估白血病和淋巴瘤 MRD特别有用，因为此类克隆型通常具有独特的序列，这些独特的序列可 用作这些克隆型的相关癌细胞的分子标签。由于此类扩增是高度多重化的 而难以建立，所以通常通过对编码单一受体链的核酸进行扩增和测序来部 分地进行此类测定。随着多重扩增规模增大而遇到了若干问题，包括：由 错误杂交引起的假性扩增的概率增加、形成引物二聚体、变化的扩增率导 致序列表征偏倚等等，例如Elnifro et al,Clinical Microbiology Reviews, 13(4):559-570(2000)(Elnifro等人，《临床微生物学评论》，2000年，第 13卷，第4期，第559-570页)。此外，无论对于序列分析、样本跟踪、 污染检测，还是诸如此类的工作，靶序列的相似性以及将序列标签掺入扩 增序列均会加剧上述与大规模扩增有关的困难。这些困难阻碍了多免疫受 体链的大规模单反应扩增的发展，而多免疫受体链的大规模单反应扩增将 非常有利于减少测定微小病灶相关核酸序列所需的单独测定数。
[0008]鉴于上文所述，如果存在更有效的方法用于评估在单一反应中选定的 核酸，如癌基因的外显子或编码免疫受体链组的克隆型，那将会非常有 利。
技术实现思路
[0009]本专利技术涉及如下方法：在单一反应中对靶多核苷酸(如编码免疫受体 链的重组核酸)群体进行大规模扩增，特别是通过聚合酶链反应(PCR)进行 大规模扩增，随后采用大规模DNA测序对其进行鉴定。本专利技术包括将上述 方法应用于监测癌症的微小残留病灶。在多个具体实施和应用中示例了本 专利技术，其中一些汇总如下并贯穿于整个说明书中。
[0010]在一些实施例中，本专利技术涉及生成核酸谱的方法，所述核酸编码所关 注的生物分子(如免疫受体分子)群体。在一个方面，本专利技术的方法包 括：将序列标签附接到样本中选定的核酸群体以形成标签-核酸缀合物；扩 增该标签-核酸缀合物；以及对扩增的标签-核酸缀合物进行测序，以提供序 列读段，每条序列读段均包含标签序列和核酸序列，针对这些序列生成核 酸谱。在一些实施例中，序列标签的附接通过一个或多个连续的引物延伸 和引物去除步骤实现，然后可通过通用的正向引物和反向引物无偏倚地进 一步扩增所得产物。在一些实施例中，本专利技术涉及一些方法，用于检测和 测定样本中由源于不同样本的物质所带来的污染(如遗留污染)。
[0011]在一个实施例中，此类用于检测受到微小残留病灶监测的个体中污染 的方法可包括以下步骤：(a)从个体获得组织样本；(b)将序列标签附接到癌 基因分子或重组核酸形成标签-核酸缀合物，其中至少一个核酸或其拷贝所 附接的序列标签不同，并且其中癌基因分子为该个体的癌症所特有的；(c) 扩增该标签-核酸缀合物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测被治疗癌症的患者的微小残留病灶的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将序列标签附接到从所述患者获取的包含T细胞和/或B细胞和/或无细胞DNA或RNA的样本中的多个重组核酸的每一个以形成标签-核酸缀合物，其中至少一个重组核酸或其拷贝附接有不同的序列标签并且是所述患者的所述癌症所特有的，并且其中所述附接包括：(i)在反应混合物中，使第一组引物在引物延伸条件下与所述样本混合，其中所述第一组中的每个引物均包含受体特异性部分、包含第一引物结合位点的5
’
非互补端、和位于所述受体特异性部分与所述第一引物结合位点之间的序列标签，其中所述受体特异性部分在第一预定位置处与不同的重组核酸退火并延伸以形成第一延伸产物；和(ii)在引物延伸条件下向所述反应混合物添加第二组引物，其中所述第二组中的每个引物均具有受体特异性部分，其中所述受体特异性部分在第二预定位置处与所述第一延伸产物退火，并且其中所述第二组中的每个引物延伸以形成第二延伸产物，其中每个第二延伸产物包含第一引物结合位点、序列标签、和编码T细胞受体链或B细胞受体链的一部分的重组核酸；(b)扩增所述标签-核酸缀合物；(c)对所述标签-核酸缀合物的样本测序以提供序列读段，所述序列读段各自包含标签序列和重组核酸序列；(d)比对具有类似标签序列的序列读段，以形成具有相同序列标签的序列读段组；(e)合并各组的重组核酸序列以确定克隆型，其中每当所述重组核酸序列组有至少99.9％的可能性是不同的时，则将所述序列读段组合并成不同的克隆型；以及(f)在克隆型谱中检测与所述患者的所述癌症相关的克隆型的存在与否和/或存在水平，由此检测所述患者中的所述微小残留病灶。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增包括在所述反应混合物中进行聚合酶链反应以形成扩增子，所述聚合酶链反应使用特异于所述第一引物结合位点的正向引物和特异于所述第二组引物的反向引物。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组核酸包括编码TCRβ、TCRδ和T...
【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：适应生物技术公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。