上转换荧光纳米探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种上转换荧光纳米探针及其应用，通过以上转换荧光纳米颗粒(UCNPs)为能量供体、有机染料FAM为能量受体，基于分子信标模型构建检测卵巢癌标志物CA125的荧光分析体系。基于UCNPs与FAM二者间的荧光共振能量转移引起UCNPs上转换荧光猝灭，而CA125与适配体序列的特异性识别打开DNA的发卡型结构，从而抑制FRET过程并恢复UCNPs的上转换荧光强度。本发明专利技术制得的纳米探针对CA125具有较高的灵敏度及选择性，其检出限可达0.017U/mL，因此可用于人血清中CA125的定量检测，并有望用于临床上卵巢恶性肿瘤的早期诊断。上卵巢恶性肿瘤的早期诊断。上卵巢恶性肿瘤的早期诊断。

【技术实现步骤摘要】
上转换荧光纳米探针及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种上转换荧光纳米探针及其应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤(癌症)具有细胞无限增殖、易转移等特点，是致死率最高的重大疾病。其中，卵巢癌是致死率较高的妇科恶性肿瘤。目前，卵巢癌患者多在肿瘤发展晚期才得以确诊，确诊后患者存活超过5年的比例不到50％(Webb P M,Jordan S J.Epidemiology of epithelial ovarian cancer[J].Best Practice&Research Clinical Obstetrics&Gynaecology,2017,41:3-14.)。早期确诊可使患者存活超过5年的比例提升到90％(Baci D,Bosi A,Gallazzi M,et al.The ovarian cancer tumor immune microenvironment(TIME)as Target for Therapy:A Focus on Innate Immunity Cells as Therapeutic Effectors[J].International Journal of Molecular Sciences,2020,21:3125.)，且卵巢癌的早期诊断是提高其治愈率的重要手段。因此，开发卵巢癌早期诊断的策略具有重要意义。CA125是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的卵巢癌标志物，其浓度与卵巢癌的发生、发展密切相关。绝大部分卵巢癌患者血清中的CA125浓度偏高(正常人一般低于35U/mL)，因此可作为卵巢癌早期诊断的辅助手段。
[0003]目前，已经发展了多种检测CA125的方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、光电免疫分析、微流控芯片电泳等方法。但是这些方法具有检测步骤繁琐、灵敏度低等缺点，限制了其在实际样品检测分析中的应用。
[0004]基于FRET(荧光共振能量转移)策略的荧光探针是一种操作简单的均相荧光分析技术，其检测过程不需样品预处理，可直接进行血清内生物组分的定量分析。通过将待测目标物与探针反应后抑制或促进FRET过程引起探针荧光信号增强或减弱，进而可根据荧光强度变化计算出目标物浓度。其中，荧光增强型FRET探针具有更高的灵敏度，将其用于CA125的分析检测将具有重要价值。然而，现有的FRET荧光分析体系多采用可见光激发的荧光材料为能量供体。在可见光激发下，生物样品会产生较强的自发荧光，从而给检测结果带来严重干扰，而致使上转换探针在分析中的准确性严重受限。

技术实现思路

[0005]为了改善上述技术问题，本专利技术提供一种基于上转换荧光材料耦合FAM染料的探针及其在检测CA125中的应用，只需通过简单混合上转换荧光纳米探针和待测目标物，即可实现血清中的CA125的精准检测，具有快速简易、高灵敏度、高选择性和低成本等优点。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供一种上转换荧光纳米探针，其包括UCNPs、有机染料FAM(即羧基荧光素)以及发卡型DNA；UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，满足FRET发生的距离要求；所述UCNPs指镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，UCNPs的发射光谱与FAM的吸收光谱相匹配。
[0008]其中，UCNPs为FRET过程的能量供体，FAM为FRET过程的能量受体。
[0009]根据本专利技术的实施方案，所述UCNPs为水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，可以以化学式NaYF4:Ln
3+
表示，其中Ln可以选自稀土元素La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种。
[0010]根据本专利技术示例性的实施方案，所述UCNPs可以选自NaYF4:Yb
3+
:Tm
3+
或NaYF4:Er
3+
,Yb
3+
。
[0011]根据本专利技术的实施方案，所述UCNPs可以选自平均粒径7～200nm的纳米颗粒，如10～80nm；示例性地，粒径可以为10nm、20nm、25nm、40nm、50nm、80nm、100nm、150nm、200nm。
[0012]优选地，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒的表面带有羧酸基团，例如所述羧酸基团可以通过PAA(聚丙烯酸)、己二酸、柠檬酸、3-巯基丙酸等对表面无配体修饰的UCNPs进行包覆引入。优选地，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒可以为PAA-UCNPs，例如可以为PAA-NaYF4:Yb
3+
:Tm
3+
。
[0013]根据本专利技术的实施方案，所述发卡型DNA具有与待测目标物CA125的适配体Apt、以及与UCNPs表面的羧基相反应的-NH2。例如，所述适配体Apt的序列为CTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA。优选地，所述发卡型DNA为AACAACCTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAAAGGTTG-NH2。
[0014]根据本专利技术的实施方案，所述上转换荧光纳米探针可以以FAM-Apt-UCNPs表示，其通过UCNPs表面的羧基与FAM-Apt-NH2末端-NH2之间的酰胺化反应制备得到。
[0015]根据本专利技术的实施方案，所述上转换荧光纳米探针和UCNPs的上转换荧光强度的峰值在470-485nm处，优选475-483nm，示例性为478nm。
[0016]根据本专利技术的实施方案，所述有机染料FAM的吸收峰与UCNPs的发射峰相匹配，例如在470-495nm处，优选475-490nm，示例性为488nm。
[0017]本专利技术还提供上述上转换荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：在交联剂存在下，将FAM-Apt-NH2与UCNPs共价偶联，制备得到所述上转换荧光纳米探针。
[0018]根据本专利技术的实施方案，所述交联剂包括EDC
·
HCl和Sulfo-NHS。
[0019]根据本专利技术的实施方案，所述UCNPs具有如上文所述的含义，优选为表面带有羧酸基团的UCNPs。
[0020]根据本专利技术的实施方案，所述表面带有羧酸基团的UCNPs的制备过程包括：将表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒与有机酸反应，得到所述表面带有羧酸基团的UCNPs。例如，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒为稀土元素掺杂的NaYF4纳米材料，所述稀土元素选自La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种。
[0021]例如，所述有机酸可以为聚丙烯酸、己二酸、柠檬酸或3-巯基丙酸等。优选地，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒与有机酸的用量比为1mg：(0.1～5)nmol；优选为1mg：(0.1～1)nmol；示例性为1mg：0.1n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种上转换荧光纳米探针，其特征在于，所述纳米探针其包括UCNPs、有机染料FAM(即羧基荧光素)以及发卡型DNA；UCNPs与FAM分别连接于发卡型DNA的两端，满足FRET发生的距离要求；所述UCNPs指镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，UCNPs的发射光谱与FAM的吸收光谱相匹配。其中，UCNPs为FRET过程的能量供体，FAM为FRET过程的能量受体。2.如权利要求1所述的上转换荧光纳米探针，其特征在于，所述UCNPs为水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒，可以以化学式NaYF4:Ln
3+
表示，其中Ln可以选自稀土元素La、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu中的一种、两种或更多种。优选地，所述UCNPs可以选自NaYF4:Yb
3+
:Tm
3+
或NaYF4:Er
3+
,Yb
3+
。优选地，所述UCNPs可以选自平均粒径7～200nm的纳米颗粒，如10～80nm。优选地，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒的表面带有羧酸基团，例如，所述羧酸基团可以通过PAA(聚丙烯酸)、己二酸、柠檬酸、3-巯基丙酸等对表面无配体修饰的UCNPs进行包覆引入。优选地，所述水溶性镧系元素掺杂的上转换荧光纳米颗粒可以为PAA-UCNPs，例如可以为PAA-NaYF4:Yb
3+
:Tm
3+
。3.如权利要求1或2所述的上转换荧光纳米探针，其特征在于，所述发卡型DNA具有与待测目标物CA125的适配体Apt、以及与UCNPs表面的羧基相反应的-NH2。例如，所述适配体Apt的序列为CTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA。优选地，所述发卡型DNA的序列为AACAACCTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAAAGGTTG-NH2。优选地，所述上转换荧光纳米探针可以以FAM-Apt-UCNPs表示，其通过UCNPs表面的羧基与FAM-Apt-NH2末端-NH2之间的酰胺化反应制备得到。优选地，所述上转换荧光纳米探针和UCNPs的上转换荧光强度的峰值在470-485nm处，优选475-483nm，示例性为478nm。优选地，所述有机染料FAM的吸收峰与UCNPs的发射峰相匹配，例如在470-495nm处，优选475-490nm，示例性为488nm。4.权利要求1-3任一项所述上转换荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在交联剂存在下，将FAM-Apt-NH2与UCNPs共价偶联，制备得到所述上转换荧光纳米探针。优选地，所述交联剂包括EDC
·
HCl和Sulfo-NHS。优选地，所述UCNPs具有如上文所述的含义，优选为表面带有羧基的UCNPs。优选地，所述表面带有羧酸基团的UCNPs的制备过程包括：将表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒与有机酸反应，得到所述表面带有羧酸基团的UCNPs。例如，所述有机酸可以为聚丙烯酸、己二酸、柠檬酸或3-巯基丙酸。优选的，UCNPs与有机酸的用量比为1mg：(0.1～5)nmol；优选为1mg：(0.1～1)nmol。优选地，所述表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒可以通过酸洗表面带有油酸和/或油胺的UCNPs纳米颗粒制备得到。优选地，所述酸洗处理具体包括如下步骤：a)配制pH在0.5～1.5之间的乙醇酸溶液；
b)将表面带有油酸和/或油胺的UCNPs纳米颗粒溶解于步骤a)所述乙醇酸溶液中，超声、洗涤后，得到表面无配体修饰的UCNPs纳米颗粒；优选地，所述表面带有油酸和/或油胺等UCNPs纳米颗粒在乙醇酸溶液中的浓度为1～3mg/mL，所述超声的时间为1～4h，所述洗涤可以依次用乙醇和去离子水洗涤数次。优选地，所述共价偶联的温度为30～50℃；优选为35～40℃。优选地，所述共价偶联的时间为1～24h；优选为4～18h。优选地，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括在共价偶联之前，需要先活化UCNPs表面的羧基。例如，活化方法包括：通过先将表面带有羧基的UCNPs、EDC
·
HCl和Sulfo-NHS依次溶于MES缓冲溶液中振摇，以活化UCNPs表面的羧基。优选地，所述表面带有羧基的UCNPs(例如PAA-UCNPs)、EDC
·
HCl和Sulfo-NHS的用量比为1mg：(0.1-0.8)mg：(0.2-2)mg；优选为1mg：(0.1-0.5)mg：(0.5-1)mg。优选地，所述活化的温度为30～50℃；优选为35～40℃。优选地，所述活化的时间为0.5～2h；优选为0.5～1h。优选地，所述纳荧光米探针的制备方法还包括对表面羧基活化后的UCNPs进行固液分离得到反应产物的过程。例如，所述固液分离可以采用本领域已知手段，比如离心。优选地，所述表面羧基活化后的UCNPs可以以固体形式加入FAM-Apt-NH2的缓冲溶液中。优选地，所述UCNPs(例如PAA-UCNPs)与FAM-Apt-NH2的用量比为1mg：(0.1-2)nmol；优选为1mg：(0.5-1)nmol。优选地，所述上转换荧光纳米探针的制备方法还包括待反应结束后，加入封闭剂封闭剩余的Sulfo-NHS...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春涯，张肖静，王炎英，梁涛，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：