具有增加的脂质产生的微生物和组合物及其制备和使用方法技术

本发明专利技术提供了一种突变体藻类微生物，所述突变体藻类微生物具有使TrifuncB和/或TrifuncA的表达弱化并且因此产生比对照藻类微生物更多的脂质的突变。所述突变体藻类微生物可以进一步包含对如ACO1或PXA1基因等过氧化物酶体β氧化通路蛋白或如ICL1基因等乙醛酸通路蛋白进行编码的基因中的突变，所述突变导致表达弱化以及脂质产生进一步增加。此外，本文提供了使用所述突变体藻类微生物产生脂质的方法以及制备突变体微生物的方法。质的方法以及制备突变体微生物的方法。质的方法以及制备突变体微生物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增加的脂质产生的微生物和组合物及其制备和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35 U.S.C.
§
119(e)要求于2018年7月23日提交的美国序列号62/702,253的优先权权益，所述申请的全部内容通过引用整体并入本文。
[0003]序列表的并入
[0004]所附序列表中的材料特此通过引用并入到本申请中。名称为SGI2190_1WO_Sequence_Listing的所附序列表文本创建于2019年7月16日并且大小为162kb。可以在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word访问此文件。


[0005]本专利技术涉及具有增加的脂质生产力的突变体藻类微生物及其在产生脂质中的用途。

技术介绍

[0006]已经通过尝试操纵对用于氮同化或脂质代谢的酶进行编码的基因以及对涉及脂质储存的多肽进行编码的基因而进行通过增加脂质生物合成来改进脂质生产力的多种尝试。例如，US 2014/0162330公开了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)菌株，其中通过基于RNAi的敲低弱化硝酸还原酶(NR)基因的表达；Trentacoste等人((2013)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》110:19748-19753)公开了用靶向被预测涉及脂质分解代谢的Thaps3_264297基因的RNAi构建体转化的硅藻；以及WO 2011127118公开了用对油质蛋白(脂质储存蛋白)进行编码的基因以及用对二酰基甘油转移酶(DGAT)基因进行编码的基因转化衣藻(Chlamydomonas)。尽管在每种情况下基于显微术或用亲脂性染料染色断言脂质生产增加，但是没有提供由操纵的细胞生产的脂质的定量，也没有确定生物质与脂质生产力之间随时间推移的关系。
[0007]Daboussi等人2014(《自然通讯(Nature Comm.)》5:3881)报道了在三角褐指藻中破坏UGPase基因导致脂质积累增加，所述三角褐指藻被认为提供昆布多糖(laminarin)(储存碳水化合物)合成的前体。然而，没有显示生物化学数据表明昆布多糖含量受到影响(或甚至存在)并且没有报道脂质和生物质生产力。类似地，若干个小组已经报道了在衣藻无淀粉突变体中脂质积累的增加(Wang等人2009,《真核细胞(Eukaryotic Cell)》8:1856-1868；Li等人2010,《代谢工程学(Metab Eng.)》12:387-391)，然而，实际测量脂质生产力的连续报道得出结论：这些菌株在光养条件下生长时生长受损(Siaut等人(2011),《BMC生物技术(BMC Biotechnol.)》11:7；Davey等人2014,《真核细胞(Eukaryot Cell)》13:392-400)。这些报道得出结论，野生型亲本菌株实际上实现了最高的脂质生产力(以TAG每升每天测量)。
[0008]WO 2011/097261和US 20120322157报道了对抑制蛋白进行编码的被称为“SN03”的基因在衣藻中过表达时在营养充满条件下具有增加脂质产生的作用。然而，观察到SN03基因的过表达导致未标识的极性脂质(其未被定量)的出现，并且不导致甘油三酯(TAG)的增加。Boyle等人((2012)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》287:15811-15825)描述了被标识
为潜在地调节应激诱导的脂质生物合成的另一种多肽。在衣藻中敲除对“SQUAMOUSA”结构域多肽进行编码的NRR1基因导致在氮耗尽下的脂质生物合成相对于野生型细胞减少；然而，没有获得显示脂质产生增加的突变体。US 2010/0255550建议在藻类细胞中过表达推定的转录因子(“TF1、TF2、TF3、TF4和TF5”)以增加脂质产生，但是没有公开脂质产生增强的突变体。
[0009]US 2017/005803公开了ZyCys调节基因，当在包含硝酸盐的培养基中培养时，所述调节基因的弱化导致突变体藻类中脂质生产力增加。突变体藻类在培养物中显示生长，以野生型细胞的至少80％的速率积累生物质，同时产生多达野生型祖代菌株两倍的脂质。US 2017/0121742公开了突变体藻类，其具有弱化的对具有溴结构域和TAZ锌指结构域的多肽进行编码的基因的表达，其证明了相对于野生型藻类提高的脂质生产力和生物质生产力的最小降低。
[0010]脂肪酸降解发生在植物和真菌的过氧化物酶体中，而在动物中，线粒体在脂肪酸的β氧化中发挥重大作用(Poirier等人,(2006)《生物化学与生物物理学学报(Biochem Biophys Acta)》1763:1413-1426；Bartlett和Eaton(2004),《欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)》271:462-469)。Germain等人(《植物学杂志(Plant J.)》28:1-12,2001)公开了在对过氧化物酶体3-酮酰基-CoA硫解酶进行编码的KAT2基因中突变的拟南芥属(Arabidopsis)幼苗证明在发育中的幼苗中脂质体和TAG的持久性，以及Slocombe等人,(《植物生物技术杂志(Plant Biotechnol.J.)》7:694-703,2009)公开了具有对过氧化物酶体转运蛋白或过氧化物酶体酰基-CoA氧化酶进行编码的突变基因的拟南芥属植物在衰老叶中TAG积累增加。US 2016/0097066提出弱化对过氧化物酶体β氧化通路的组分进行编码的基因在产油酵母(如耶氏酵母属(Yarrowia))中的表达，包含酰基-CoA氧化酶、多功能酶(包含羟酰基-CoA脱氢酶和烯酰基-CoA水合酶的结构域)以及氧酰基-CoA硫解酶，以改进脂肪酸生产，但是US 2016/0215308公开了破坏过氧化物酶体转运蛋白(PXA2)和过氧化物酶体酰基-CoA氧化酶(POX1)的基因未改进在被工程化以过量生产脂肪酸的酵母属(Saccharomyces)菌株中的脂肪酸生产。

技术实现思路

[0011]在第一方面，本文提供了一种突变体微生物，如藻类或不等鞭毛体微生物，所述突变体微生物具有弱化的编码线粒体β氧化通路的多肽的至少一个基因的表达。例如，使其表达弱化的基因可以编码酰基-CoA脱氢酶、三功能蛋白α亚基或三功能蛋白β亚基。在一些实施例中，突变体微生物包含导致线粒体三功能蛋白亚基B(TrifuncB)和/或线粒体三功能蛋白亚基A(TrifuncA)的表达弱化的突变。对线粒体β氧化通路的多肽进行编码的基因的表达相对于对照微生物(例如，突变体微生物源自其的菌株的微生物)是弱化的。可以通过基因工程化使基因的表达弱化或可以是经典突变的结果。相比于对照藻类或真菌微生物(例如，野生型微生物或来自突变体微生物的微生物)，具有弱化的对线粒体β氧化通路的多肽进行编码的基因表达的微生物可以具有更高的脂质生产力，并且例如可以在每日基础上积累更多的脂质。
[0012]本文提供的具有弱化的编码线粒体β氧化通路的多肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种突变体微生物，相比于与所述突变体微生物相同物种的对照微生物，其在每体积每天的基础上产生更多的可脂肪酸甲酯衍生的脂质(FAME脂质)，其中所述突变体微生物包括导致线粒体三功能蛋白亚基B(TrifuncB)和/或线粒体三功能蛋白亚基A(TrifuncA)的表达弱化的突变。2.一种突变体微生物，其包括线粒体三功能蛋白亚基B(TrifuncB)基因和/或线粒体三功能蛋白亚基A(TrifuncA)基因中的突变，其中当在相同条件下培养时，所述突变使所述TrifuncB基因和/或所述TrifuncA基因的表达弱化，并且与除了所述突变之外在基因上与所述突变体微生物相同的对照微生物相比，所述突变导致体积脂质生产力增加。3.一种突变体微生物，其表现出比在相同条件下培养的同一物种的野生型微生物的可脂肪酸甲酯衍生的脂质与总有机碳(FAME/TOC)比率高至少15％的FAME/TOC比率，其中所述突变体微生物具有弱化的线粒体三功能蛋白亚基B(TrifuncB)和/或线粒体三功能蛋白亚基A(TrifuncA)的表达。4.根据权利要求1、2或3所述的突变体微生物，其中所述突变导致TrifuncB的表达弱化。5.根据权利要求1、2或3所述的突变体微生物，其进一步包括对过氧化物酶体β氧化通路蛋白进行编码的基因或对乙醛酸通路蛋白进行编码的基因中的突变，其中所述突变导致所述过氧化物酶体β氧化通路蛋白或所述乙醛酸通路蛋白的表达弱化。6.根据权利要求5所述的突变体微生物，其中所述过氧化物酶体β氧化通路蛋白是酰基-CoA氧化酶1(ACO1)或过氧化物酶体ABC型酰基-辅酶A转运蛋白(PXA1)。7.根据权利要求5所述的突变体微生物，其中所述乙醛酸通路蛋白是异柠檬酸裂解酶(ICL)。8.根据权利要求1或2所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物显示出比所述对照微生物更高的可脂肪酸甲酯衍生的脂质与总有机碳的比率(FAME/TOC比率)。9.根据权利要求8所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物表现出比所述对照微生物的FAME/TOC比率高至少15％的FAME/TOC比率。10.根据权利要求4或5所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物表现出比所述对照微生物的FAME/TOC比率高至少30％的FAME/TOC比率。11.根据权利要求10所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物表现出比所述对照微生物的FAME/TOC比率高至少40％的FAME/TOC比率，其中所述弱化的过氧化物酶体β氧化通路蛋白是酰基-CoA氧化酶1(ACO1)或过氧化物酶体ABC型酰基辅酶A转运蛋白(PXA1)。12.根据权利要求11所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物表现出比所述对照微生物的FAME/TOC比率高至少50％的FAME/TOC比率，其中所述弱化的过氧化物酶体β氧化通路蛋白是ACO1。13.根据权利要求1或2所述的突变体微生物，其中所述突变是敲除突变。14.根据权利要求1或2所述的突变体藻类微生物，其中所述突变是敲低突变。15.根据权利要求1或2所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物包括用于表达至少一个反义分子、至少一个RNAi分子或用于使TrifuncB基因或TrifuncA基因的表达弱化的至少一种核酶的重组核酸分子。16.根据权利要求1所述的突变体藻类微生物，其中外源DNA存在于所述TrifuncB基因
或所述TrifuncA基因中，由此使所述基因的表达弱化。17.根据权利要求2所述的突变体藻类微生物，其中外源DNA存在于所述TrifuncB基因或所述TrifuncA基因中，由此使所述基因的表达弱化。18.根据权利要求16或17所述的突变体藻类微生物，其中所述外源DNA包括未在对照藻类微生物的基因组中发现的标记基因。19.根据权利要求1或2所述的突变体微生物，其中所述突变在Cas PAM序列上游的25个碱基对内。20.根据权利要求1或2所述的突变体微生物，其中所述突变体微生物包括对Cas蛋白进行编码的核酸序列。21.根据权利要求5所述的突变体微生物，其中对过氧化物酶体β氧化通路蛋白进行编码的所述基因中的所述突变是酰基-CoA氧化酶1(ACO1)基因的敲除突变。22.根据权利要求21所述的突变体微生物，其中所述TrifuncB基因和/或所述TrifuncA基因中的所述突变是敲除突变。23.根据权利要求5所述的突变体微生物，其中对过氧化物酶体β氧化通路蛋白进行编码的所述基因中的所述突变是所述过氧化物酶体ABC型酰基-辅酶A转运蛋白(PXA1)基因的敲除突变。24.根据权利要求23所述的突变体微生物，其中所述TrifuncB基因和/或所述TrifuncA基因中的所述突变是敲除突变。25.根据权利要求5所述的突变体微生物，其中对乙醛酸通路蛋白进行编码的所述基因中的所述突变是所述异柠檬酸裂解酶(ICL)基因中的敲除突变。26.根据权利要求25所述的突变体微生物，其中所述TrifuncB基因中的所述突变是敲除突变。27.根据权利要求1、2或3所述的突变体微生物，其中相对于所述对照微生物，所述突变体微生物在每体积每天的基础上比在充满氮的培养条件下的所述对照微生物产生更多的FAME脂质。28.根据权利要求1所述的突变体藻类微生物，其中在分批、半连续或连续培养中，所述突变体微生物显示出比所述对照微生物更高的FAME生产力。29.根据权利要求1、2或3所述的突变体藻类微生物，其中在光合自养的培养条件下，所述突变体微生物显示出比所述对照微生物更高的FAME生产力。30.根据权利要求1、2或3所述的突变体藻类微生物，其中所述突变体微生物是藻类微生物。31.根据权利要求30所述的突变体藻类微生物，其中所述突变体藻类微生物是一种曲壳藻(Achnanthes)、茧形藻(Amphiprora)、双眉藻(Amphora)、纤维藻(Ankistrodesmus)、星胞藻(Asteromonas)、黄金色藻(Boekelovia)、波利氏藻(Bolidomonas)、包特氏菌(Borodinella)、气球藻(Botrydium)、葡萄藻(Botryococcus)、荀球藻(Bracteococcus)、角毛藻(Chaetoceros)、四鞭藻(Carteria)、衣藻(Chlamydomonas)、绿球藻(Chlorococcum)、绿梭藻(Chlorogonium)、小球藻(Chlorella)、蓝隐藻(Chroomonas)、金球藻(Chrysosphaera)、球钙板藻(Cricosphaera)、隐甲藻(Crypthecodinium)、隐藻(Cryptomonas)、小环藻(Cyclotella)、链带藻(Desmodesmus)、杜氏藻(Dunaliella)、后棘
藻(Elipsoidon)、球石藻(Emiliania)、独球藻(Eremosphaera)、衣迪斯藻(Ernodesmius)、眼虫藻(Euglena)、真眼点藻(Eustigmatos)、伏氏藻(Franceia)、脆杆藻(Fragilaria)、拟脆杆藻(Fragilaropsis)、丽丝藻(Gloeothamnion)、红球藻(Haematococcus)、菱板藻(Hantzschia)、异弯藻(Heterosigma)、膜胞藻(Hymenomonas)、等鞭金藻(Isochrysis)、鳞孔藻(Lepocinclis)、微芒藻(Micractinium)、蒜头藻(Monodus)、单针藻(Monoraphidium)、微球藻(Nannochloris)、微拟球藻(Nannochloropsis)、舟形藻(Navicula)、新绿藻(Neochloris)、肾鞭藻(Nephrochloris)、肾爿藻(Nephroselmis)、菱形藻(Nitzschia)、棕鞭藻(Ochromonas)、鞘藻(Oedogonium)、卵囊藻(Oocystis)、蚝球藻(Ostreococcus)、拟小球藻(Parachlorella)、雪衣藻(Parietochloris)、杜氏亚属盐藻(Pascheria)、巴夫藻(Pavlova)、普莱格门(Pelagomonas)、褐指藻(Phoeodactylum)、噬菌体(Phagus)、皮级微绿藻(Picochlorum)、扁藻(Platymonas)、颗石藻(Pleurochrysis)、宽球藻(Pleurococcus)、原壁菌(Prototheca)、假小球藻(Pseudochlorella)、拟新绿藻(Pseudoneochloris)、假十字趾藻(Pseudostaurastrum)、塔胞藻(Pyramimonas)、葡串藻(Pyrobotrys)...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：合成基因组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：