一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9定向编辑水稻Os03g0393900基因第3外显子特定序列，获得该序列缺失若干碱基的突变体，该突变体自交或杂交后代产生较高频率单倍体，针对突变序列开发出功能性分子标记引物并应用于水稻单倍体诱导性状的改良。与传统花药培养获得单倍体相比，本发明专利技术在产生单倍体时，不受籼粳花药培养力基因型的影响，操作过程更为简便，提高了单倍体产生效率。倍体产生效率。倍体产生效率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物及其应用。

技术介绍

[0002]水稻(Oryza sativa L.)是我国重要的粮食作物之一，水稻的产量和品质直接影响着我国粮食安全与人民生活品质。水稻品种的高效选育是提高水稻产量、品质和抗性的关键环节。传统育种中需要6～8个世代连续自交和不断选择才能获得相对稳定的材料，周期较长，难以满足水稻育种需求。双单倍体育种(double haploid,DH技术)只需2个世代就能获得纯系，大大缩短了育种进程，是纯系选育的一次技术革命。单倍体的产生是双单倍体育种的第一步，自然发生单倍体的频率很低，仅为0.1％，无法满足育种的大量需求。在水稻中，利用花药进行离体培养，诱导花药产生愈伤组织再分化成单倍体植株，是产生水稻单倍体的主要方法。但是，水稻的花药培养具有严格的基因型依赖且操作复杂，如籼稻的花药培养能力显著弱于粳稻。因此，水稻单倍体的产生一直是制约着水稻双单倍体育种的瓶颈。
[0003]近年来，在玉米中以生物诱导为基础的DH技术已被国内外种业公司及育种单位广泛的应用，成为了与分子标记辅助育种和转基因技术并称的现代玉米三大育种技术。生物诱导产生孤雌生殖单倍体是利用单倍体诱导系作父本，与目标选系基础材料进行杂交，在杂交当代的籽粒上就能获得一定比例的母本血缘单倍体。利用诱导系产生单倍体具有不受基因型依赖、诱导过程简单、成本低廉等优势。在玉米中，诱导单倍体产生的性状受主效QTL控制，其中qhir1能够解释66％遗传变异。2017年美国、中国和法国科学家几乎同时克隆qhir1位点的花粉特异性磷脂酶A基因MTL/ZmPLA1/NLD(GRMZM2G471240)。在玉米单倍体诱导系中，该基因在第4外显子1572～1573之间有个4bp(CGAG)插入，造成20个氨基酸移码突变，导致翻译提前终止，产生单倍体诱导功能。
[0004]MTL在作物中高度保守，水稻中MTL同源基因为(Os03g0393900)。玉米中MTL基因不同位点突变后单倍体产生比率不同，水稻中Os03g0393900基因不同位点的突变是否会影响单倍体产生还有待探索。鉴于传统水稻单倍体产生难度较大，提供一种基于Os03g0393900基因生物诱导的单倍体产生方法对水稻双单倍体育种有着重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物，该分子标记引物序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供所述分子标记引物在提高水稻单倍体诱导效率中的应用。
[0007]进一步的，所述应用包括以下步骤：
[0008](1)以水稻Os03g0393900基因第三外显子为基础设计靶序列；
[0009](2)构建靶序列的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌转化水稻成熟胚诱导的愈伤
组织；
[0010](3)通过潮霉素抗性筛选及测序获得Os03g0393900基因第三外显子靶位点纯合突变体；
[0011](4)对纯合突变体利用分子标记引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选。
[0012]更进一步的，所述步骤(1)中靶序列为Os03g0393900第三外显子115-147位置，具体序列为：5
’-
CGTCGATGAGGTCGAACTCGCGGACCTTGCCGG-3
’
。
[0013]更进一步的，所述步骤(2)中水稻品种为籼稻纯系品种华航48。
[0014]更进一步的，所述步骤(3)中靶位点纯合突变体为：Os03g0393900第三外显子115-147位置为CGTCGATGAGGT
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TCGCGGACCTTGCCGG纯合突变，该突变序列相比原始序列缺失5个碱基。
[0015]更进一步的，所述步骤(4)中利用引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选的步骤为：扩增靶序列，利用凝胶电泳比较片段差异，突变型与野生型具有5个碱基的差异。
[0016]进一步的，所述应用步骤如下：利用100Gy碳离子束辐照水稻，在诱变二代对每个单株利用SEQ ID No.21和SEQ ID No.22扩增目的片段，找出目的片段比对照减少5个碱基的突变体。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0018]本专利技术基于特定基因突变和生物诱导获得单倍体，与传统花药培养获得单倍体相比，本专利技术在产生单倍体时，不受籼粳花药培养力基因型的影响，操作过程更为简便，提高了单倍体产生效率。
附图说明
[0019]图1为实施例1中OsMATL基因靶点序列及位置图。
[0020]图2为实施例1中CRISPR/Cas9载体构建示意图。
[0021]图3为实施例1中野生型和突变体OsMATL基因蛋白三级结构预测图。
[0022]图4为实施例1中启动子区293bp缺失突变体OsMATL基因相对表达量图。
[0023]图5为实施例1中野生型和OsMATL突变体的结实率图。
[0024]图6为实施例1中野生型和OsMATL突变体的败育率图。
[0025]图7为实施例1中结实表型及不同类型败育籽粒表型图。
[0026]图8为实施例1中OsMATL3突变体及其诱发的单倍体表型。
具体实施方式
[0027]以下实施例中材料为粳稻日本晴和籼稻华航48，日本晴是典型的粳型纯系品种，华航48是国家植物航天育种工程技术研究中心选育的综合性状优良的籼型纯系品种。试验材料水培种植于人工气候室(温度28℃,光照10h,黑暗14h)，所有材料常规管理。
[0028]实施例1
[0029]1.Os03g0393900生物信息学分析
[0030]利用Ensembl数据库(https://plants.ensembl.org/index)获取MTL的基因序列及氨基酸序列。通过NCBI数据库中Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析，搜索MTL在谷物和模式作物拟南芥中的同源基因，并下载同源基因的氨基酸序
列。利用Clustl Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对氨基酸序列进行多序列比对；利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和UniProt(https://www.uniprot.org/)预测Os03g0393900基因蛋白结构域。选取Os03g0393900基因ATG上游2000bp作为启动子区域，利用顺式作用元件在线分析网站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高水稻单倍体诱导效率的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示。2.根据权利要求1所述的分子标记引物在提高水稻单倍体诱导效率中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)以水稻Os03g0393900基因第三外显子为基础设计靶序列；(2)构建靶序列的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织；(3)通过潮霉素抗性筛选及测序获得Os03g0393900基因第三外显子靶位点纯合突变体；(4)对纯合突变体利用分子标记引物SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行筛选。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中靶序列为Os03g0393900第三外显子115-147位置，具体序列为：5
’-
CGTCGATGAGGTCGAACTCGCGGACCTTGCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭涛，文钦，贾思思，王加峰，陈淳，黄翠红，周丹华，杨瑰丽，王慧，陈志强，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：