用于检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的探针组及试剂盒制造技术

一种用于检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的探针组，包括捕获检测HBA1、HBA2的第一探针组，以及捕获检测HBB的第二探针组，其中，第一探针组、第二探针组设计参考人类基因组Hg38/Hg19版本，为寡核苷酸探针，第一探针组覆盖区域按照Hg38版本为chr16:147743

【技术实现步骤摘要】
用于检测
α
地中海贫血和
β
地中海贫血相关致病基因的探针组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，特别涉及一种用于检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的探针组及试剂盒。

技术介绍

[0002]地中海贫血是高发的常染色体隐性遗传疾病，严重威胁人类健康，全球携带率约2％，在我国南方的携带率为3％-24％。
[0003]地中海贫血是由于珠蛋白基因发生缺陷，导致肽链合成减少或缺失的遗传性溶血性血红蛋白病。最常见的为α地中海贫血和β地中海贫血。临床上又根据临床表现，分为轻型(地中海贫血携带者)、中间型和重型。
[0004]成人血红蛋白是由两种共4个血红蛋白单体构成的四聚体(一对α类肽链和一对β类肽链)。只有由两条α类肽链和两条β类肽链组成的四聚体最稳定。编码α类肽链的是HBA1和HBA2两个基因，正常人有4个拷贝，定位于 16p13.3；编码β类肽链的是HBB基因，正常人有2个拷贝，定位于11p15.5。 HBA1/HBA2或HBB基因缺失或功能障碍导致相应蛋白质产物珠蛋白合成减少或者不合成，导致血红蛋白中肽链不平衡或结构异常造成人体溶血性贫血。
[0005]α地中海贫血主要由α珠蛋白基因(HBA1/HBA2)缺失引起，95％的α地中海贫血是由于α珠蛋白基因大片段缺失导致。中国人群最常见的缺失型α地中海贫血包括SEA、3.7kb和4.2kb这三种。非缺失型α地贫点突变有30多种，最常见的为CS(CD142)、QS(CD125)和WS(CD122)。r/>[0006]β地中海贫血主要由HBB基因突变或者缺失导致，主要以点突变及小的插入缺失为主。目前全球发现200多种HBB基因变异。中国人最常见为点突变 CD41-42、CD17、-28、CD26、IVS—654和CD71-72这六种点突变，占全部突变类型的约90％。
[0007]地中海贫血携带者临床表型完全正常或者非常轻微，如果夫妻双方均为相同地中海贫血致病基因的携带者，则有四分之一几率下一代为地中海贫血的患者。目前地中海贫血缺乏理想的治疗方法，因此地中海贫血的筛查能根本上防止地中海贫血的发生。地中海贫血的临床基因筛查一般使用Gap-PCR、PCR-RDB 的方法检测常见的HBA1/HBA2基因的三种缺失及三种点突变、HBB基因的17 种点突变，而且检测不同突变类型、不同基因的试剂盒产品均为单独的产品，检测不便，且全面检测的费用较高。
[0008]因此临床上需要一种HBA1/HBA2、HBB基因同时检测，且覆盖突变种类更为全面的检测方法及产品，以期实现对地中海贫血的高效、准确、全面、快速检测，这对于提高我国人口素质、出生缺陷防控及优生优育有重要意义。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的之一是针对现有技术的不足，提供一种用于检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的探针组，其可以同时检测HBA1、HBA2和 HBB基因，且可以检测所有
目前已知α地中海贫血和β地中海贫血的323种突变类型。
[0010]本专利技术的目的之二是提供包括上述探针组的试剂盒。
[0011]实现本专利技术目的之一的技术方案是：一种检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的探针组，包括捕获38检测HBA1、HBA2的第一探针组，以及捕获检测HBB的第二探针组，其中，第一探针组、第二探针组设计参考人类基因组Hg38/Hg19版本，为寡核苷酸探针，第一探针组覆盖区域按照Hg38版本为chr16:147743-185701，按照Hg19版本为chr16:197742-235700，第二探针组覆盖区域按照Hg38版本为chr11：5225597-5227178，按照Hg19版本为 chr11:5246827-5248408。
[0012]优选的，各探针组中的探针分别由生物素标记。
[0013]进一步的，第一探针组、第二探针组设计时避开重复区域，重复区域用 RepeatMask软件得到，根据设计区域的GC含量不同，调整探针密度，探针密度公式为：
[0014]D
go
＝α+a+10+|gc-0.5|
[0015]其中，D
gc
为某GC含量的探针密度，a为为GC含量为50％时的探针密度， gc为GC含量。
[0016]实现本专利技术目的之二的技术方案是：一种检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的试剂盒，包括上述的第一探针组、第二探针组。
[0017]上述试剂盒，还包括富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液、0.1M的NaOH水溶液、1M的Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE 缓冲液。
[0018]优选的，第一探针组和第二探针组、富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液、NaOH水溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、 TE缓冲液分别独立包装。
[0019]优选的，所述富集缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为人cot-1 DNA、鲑鱼精DNA、第一引物、第二引物，其中，人cot-1DNA的体积百分比为35％，鲑鱼精DNA的体积百分比为15％，第一引物的浓度为0.5nmol/μl，其序列为 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT，第二引物的浓度为0.5nmol/μl，其序列为 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC ；所述杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为100mM Tris-HCl，pH为7.6，溶质为1.25M的NaCl、0.125M的柠檬酸钠、BSA、Tween20，其中，BSA的浓度为0.1g/100mL，Tween20的体积百分数为7％；所述结合缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为10mM Tris-HCl，pH为7.5，溶质为1M的NaCl、1mM的EDTA；所述第一漂洗液由溶剂和溶质组成，溶剂为SSC溶液，溶质为SDS，SDS的含量为0.1wt％，SSC溶液的溶剂为水，溶质为NaCl、柠檬酸三钠，其中，NaCl 的浓度为175g/L，柠檬酸三钠的浓度为88g/L，pH为7.4；所述第二漂洗液由溶剂和溶质组成，溶剂为SSC溶液稀释十倍得到，溶质为SDS，SDS的含量为 0.1wt％；所述PCR反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为Phusion缓冲液，溶质为0.2mM的dATP、0.2mM的dTTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、2.5pmol 的第三引物、0.2pmol的第四引物、0.05U/μl的Hotstart Phusion酶、体积百分比为5％的DMSO，所述Phusion缓冲液的溶剂为50mM Tris-HCl溶液，pH为 8.8，溶质为4mM的MgCl2、500mM的KCl、体积百分数为0.8％的Nonidet P40，所述第三引物的序列为AATGATACGGCGACCACCGA*G，第四引物的序列为 CAAGCAGAAGACGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的探针组，其特征在于，包括捕获检测HBA1、HBA2的第一探针组，以及捕获检测HBB的第二探针组，其中，第一探针组、第二探针组设计参考人类基因组Hg38/Hg19版本，为寡核苷酸探针，第一探针组覆盖区域按照Hg38版本为chr16:147743-185701，按照Hg19版本为chr16:197742-235700，第二探针组覆盖区域按照Hg38版本为chr11：5225597-5227178，按照Hg19版本为chr11:5246827-5248408。2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，各探针组中的探针分别由生物素标记。3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，第一探针组、第二探针组设计时避开重复区域，重复区域用RepeatMask软件得到，根据设计区域的GC含量不同，调整探针密度，探针密度公式为：D
gc
＝a+a*10*|gc-0.5|其中，D
gc
为某GC含量的探针密度，a为GC含量为50％时的探针密度，gc为GC含量。4.一种检测α地中海贫血和β地中海贫血相关致病基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至3任一所述的第一探针组、第二探针组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括组分：富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液、0.1M的NaOH水溶液、1M的Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE缓冲液。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，第一探针组和第二探针组、富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液、NaOH水溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE缓冲液分别独立包装。7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述富集缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为人cot-1DNA、鲑鱼精DNA、第一引物、第二引物，其中，人cot-1DNA的体积百分比为35％，鲑鱼精DNA的体积百分比为15％，第一引物的浓度为0.5nmol/μl，其序列为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT，第二引物的浓度为0.5nmol/μl，其序列为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGC；所述杂交缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为100mM Tris-HCl，pH为7.6，溶质为1.25M的NaCl、0.125M的柠檬酸钠、BSA、Tween20，其中，BSA的浓度为0.1g/100mL，Tween20的体积百分数为7％；所述结合缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为10mM Tris-HCl，pH为7.5，溶质为1M的NaCl、1mM的EDTA；所述第一漂洗液由溶剂和溶质组成，溶剂为SSC溶液，溶质为SDS，SDS的含量为0.1wt％，SSC溶液的溶剂为水，溶质为NaCl、柠檬酸三钠，其中，NaCl的浓度为175g/L，柠檬酸三钠的浓度为88g/L，pH为7.4；所述第二漂洗液由溶剂和溶质组成，溶剂为SSC溶液稀释十倍得到，溶质为SDS，SDS的含量为0.1wt％；所述PCR反应液由溶剂和溶质组成，溶剂为Phusion缓冲液，溶质为0.2mM的dATP、0.2mM的dTTP、0.2mM的dCTP、0.2mM的dGTP、2.5pmol的第三引物、0.2pmol的第四引物、0.05U/μl的Hotstart Phusion酶、体积百分比为5％的DMSO，所述Phusion缓冲液的溶剂为50mM Tris-HCl溶液，pH为8.8，溶质为4mM的MgCl2、500mM的KCl、体积百分数为0.8％的Nonidet P40，所述第三引物的序列为AATGATACGGCGACCACCGA*G，第四引物的序列为CAAGCAGAAGACGGCATACG*A，其中的*为硫代修饰；所述TE缓冲液由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为Tris、EDTA，Tris的浓度为10mM，EDTA的浓度为1mM，并通过添加HCl调节pH至8.0。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一探针组和第二探针组的浓度为150ng/ul，第一探针组和第二探针组、富集缓冲液、杂交缓冲液、结合缓冲液、第一漂洗液、第二漂洗液、NaOH水溶液、Tris-HCl缓冲液、PCR反应液、TE缓冲液的体积比为160：208：800：3200：9000：45000：1000：1200：580：800。9.采用权利要求5-7任一试剂盒检测地中海贫血的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)全...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，姬晓雯，王海丽，刘娜，韩路，
申请(专利权)人：北京迈基诺基因科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：