用于核酸扩增的方法和系统技术方案

本发明专利技术涉及一种用于扩增和分析核酸样品的方法，所述方法包括提供包含生物样品和对于核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，以及使所述反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，从而扩增靶核酸。此外，本申请还涉及用于实施所述方法的系统。本发明专利技术的方法和系统能够对来自复杂样品类型的核酸进行快速、准确的分析检测。准确的分析检测。准确的分析检测。

【技术实现步骤摘要】
用于核酸扩增的方法和系统
本申请是申请日为2014年12月25日、申请号为201480022014.1、专利技术名称为“用于核酸扩增的方法和系统”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2014年12月25日、申请号为PCT/CN2014/094914)的分案申请。交叉引用
[0001]本申请要求2013年12月25日提交的第PCT/CN2013/090425号专利合作条约申请的优先权，所述申请出于全部目的通过引用以整体并入本文。

技术介绍

[0002]核酸扩增方法允许从复杂混合物如生物样品中有选择地扩增和鉴定感兴趣的核酸。为了检测生物样品中的核酸，通常对生物样品进行处理，以从生物样品的其他组分和其他可能干扰核酸和/或扩增的其他物质中分离出核酸。在从生物样品中分离出感兴趣的核酸之后，可通过例如本领域已知的扩增方法，如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))，对感兴趣的核酸进行扩增。在扩增感兴趣的核酸之后，可以检测扩增产物，并由最终用户解读检测结果。然而，在核酸扩增之前从生物样品中提取核酸可能是费时的，从而导致该过程在整体上的时间效率降低。
[0003]照护点(POC)检测具有在实验室基础设施较差的资源受限的条件下或者在接收实验室结果延迟及对患者进行随访可能较复杂的偏远地区提升传染病的检测和处置的潜力。POC检测也能够使现有水平的卫生保健设施更加能够在单次访视期间为患者提供样品-反馈(sample-to-answer)结果。然而，POC方法和装置的低效限制了能够实现的目标。例如，从复杂样品类型(例如，生物样品)制备核酸(例如，病原体的核酸)需要熟练技术人员在专门的实验室空间中手动执行多个处理步骤及后续的检测，因此往往在几小时甚至几天之后才能出具结果的报告。
[0004]因此，需要用于分析来自复杂样品类型的核酸的快速、准确的方法和装置。此等方法和装置例如可用于实现可经由其核酸而检测的疾病的快速样品-反馈检测和处置。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了用于核酸如RNA和DNA分子的高效扩增的方法和系统。可快速且高灵敏度地检测所扩增的核酸产物。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对靶RNA的引物组；及(b)使反应容器中的反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增靶RNA。在另一实施方案中，该方法包括：(a)接收已从受试者获得的生物样品；(b)提供包含生物样品
和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，该试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对靶RNA的引物组；(c)使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(d)检测(c)的扩增DNA产物的量；及，将关于扩增DNA产物的量的信息输出至接收者，其中用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。在一些实施方案中，该时间量小于或等于20分钟，小于或等于10分钟，或者小于或等于5分钟。
[0007]在一些实施方案中，所述试剂进一步包含报告剂，该报告剂产生指示存在扩增DNA产物的可检测信号。在一些实施方案中，可检测信号的强度与扩增DNA产物或靶RNA的量成比例。在一些实施方案中，该报告剂是染料。在一些实施方案中，引物组包含一条或多条引物。在一些实施方案中，引物组包含用于产生与靶RNA互补的链的第一引物。在一些实施方案中，引物组包含用于产生与DNA产物互补的链的第二引物，该DNA产物与靶RNA的至少一部分互补。在一些实施方案中，靶RNA为病毒RNA。在一些实施方案中，该病毒RNA对于受试者是致病性的。在一些实施方案中，该病毒RNA选自HIV I、HIV II、埃博拉病毒、登革病毒、正粘病毒、肝炎病毒(hepevirus)，和/或甲型、乙型、丙型(例如，具甲的RNA-HCV病毒)、丁型和戊型肝炎病毒。
[0008]在一些实施方案中，所述反应容器包括主体和盖。在一些实施方案中，该盖是可移除的。在一些实施方案中，该反应容器采取移液管头(pipette tip)的形式。在一些实施方案中，该反应容器是反应容器阵列的一部分。在一些实施方案中，该反应容器阵列的反应容器部分可被液体处理装置单独寻址。在一些实施方案中，该反应容器包含两个或更多个热区(thermal zone)。在一些实施方案中，该反应容器是密封的，任选地是气密密封的。
[0009]在一些实施方案中，变性温度为约90℃至100℃，或约92℃至95℃。在一些实施方案中，延伸温度为约35℃至72℃，或约45℃至65℃。在一些实施方案中，变性持续时间少于或等于30秒。在一些实施方案中，延伸持续时间少于或等于30秒。
[0010]在一些实施方案中，在提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器前，靶RNA未经历浓缩。在一些实施方案中，当提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器时，生物样品未经历RNA提取。在一些实施方案中，该方法进一步包括在提供包含生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器之前或期间向该反应容器中加入裂解剂的步骤。在一些实施方案中，该裂解剂包含缓冲液。在一些实施方案中，在引物延伸反应的一个或多个循环期间，靶RNA从生物样品中释放。
[0011]在一些实施方案中，所述生物样品是来自受试者的生物流体。在一些实施方案中，该生物样品选自呼出气、血液、尿液、粪便、唾液、脑脊液和汗液。
[0012]在一些实施方案中，DNA扩增经由聚合酶链反应进行。在一些实施方案中，该聚合酶链反应是巢式聚合酶链反应。在一些实施方案中，DNA扩增是线性扩增。在一些实施方案中，该扩增以小于50、小于40、小于30、小于20、小于10或小于5的循环阈值(Ct)产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物。在一些实施方案中，该扩增在30分钟或更短、20分钟或更短或者10分钟或更短的时段产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的DNA产物。在一些实施方案中，该扩增不是基于乳液的。
[0013]在一些实施方案中，所述接收者是进行治疗的医师、制药公司或受试者。在一些实施方案中，使反应混合物经历多个循环的引物延伸反应以产生指示在生物样品中存在靶RNA的可检测量的扩增DNA产物进行30个循环或更少，20个循环或更少，或者10个循环或更少。在一些实施方案中，检测是光学检测、静本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，其包括：(a)提供包含所述生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对所述靶RNA的引物组；及(b)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒的延伸持续时间，从而扩增所述靶RNA。2.一种扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，其包括：(a)接收已从所述受试者获得的所述生物样品；(b)提供包含所述生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)逆转录酶和(ii)针对所述靶RNA的引物组；(c)使所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(d)检测(c)的扩增DNA产物的所述量；及(e)将关于扩增DNA产物的所述量的信息输出至接收者，其中，用于完成(a)-(e)的时间量小于或等于约30分钟。3.一种扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的方法，其包括：(a)提供包含所述生物样品和对于进行核酸扩增所必需的试剂的反应容器，以获得反应混合物，所述试剂包含(i)脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任选的逆转录酶，和(ii)针对所述靶核酸的引物组；及(b)使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个系列的引物延伸反应，以生成指示在所述生物样品中存在所述靶核酸的扩增产物，每个系列包括两个或更多个如下的循环：(i)在以变性温度和变性持续时间为特征的变性条件下孵育所述反应混合物，随后(ii)在以延伸温度和延伸持续时间为特征的延伸条件下孵育所述反应混合物，其中就所述变性条件和/或所述延伸条件而言，单个系列不同于所述多个系列中的至少一个其他单个系列。4.一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统，其包括：(a)输入模块，其接收扩增所述生物样品中的所述靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于所述用户请求：在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含所述生物样品和对于与脱氧核糖核酸(DNA)扩增平行地进行逆转录扩增所必需的试剂，所述试剂包含(i)逆转录酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)针对所述靶RNA的引物组；及使所述反应容器中的所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以生成指示存在所述靶RNA的扩增DNA产物，每个循环包括：(i)将所述反应混合物在变性温度下孵育少于或等于60秒的变性持续时间，随后(ii)将所述反应混合物在延伸温度下孵育少于或等于60秒
的延伸持续时间，从而扩增所述靶RNA；及(c)可操作地耦合至所述扩增模块的输出模块，其中所述输出模块将关于所述靶RNA或所述DNA产物的信息输出至接收者。5.一种用于扩增存在于直接从受试者获得的生物样品中的靶核糖核酸(RNA)的系统，其包括：(a)输入模块，其接收扩增所述生物样品中的所述靶RNA的用户请求；(b)扩增模块，其响应于所述用户请求：(i)在反应容器中接收反应混合物，该反应混合物包含已从所述受试者获得的所述生物样品和对于进行逆转录扩增和任选的脱氧核糖核酸(DNA)扩增所必需的试剂，所述试剂包含(1)逆转录酶，和(2)针对所述靶RNA的引物组；及(ii)使所述反应混合物经历多个循环的引物延伸反应，以产生指示在所述生物样品中存在所述靶RNA的可检测量的扩增DNA产物；(iii)检测(iii)的扩增DNA产物的所述量；及(iv)将关于扩增DNA产物的所述量的信息输出至接收者，其中，用于完成(i)-(iv)的时间量小于或等于约30分钟；及(c)可操作地耦合至所述扩增模块的输出模块，其中所述输出模块将所述信息传送至接收者。6.一种用于扩增存在于从受试者获得的生物样品中的靶核酸的系统，其包括：(a)输入模块，其接收扩增所述生物样品中的所述靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李响，
申请(专利权)人：卡尤迪生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：