一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用制造技术

本发明专利技术提供一种芽孢杆菌新菌株HSY204及其杀虫基因和应用，芽孢杆菌新菌株HSY204的分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204，其包括3个新型杀虫基因；经过生物活性测定表明菌株HSY204及其杀虫基因对埃及伊蚊幼虫具有很高的毒性，对蚊子的生长具有明显影响，可应用防控蚊虫，有效降低蚊媒疾病大规模传播的风险。传播的风险。传播的风险。

【技术实现步骤摘要】
cereus)HSY204，于2020年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为：CCTCC NO.M2020523。保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0008]进一步说明，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204包括3个新型杀虫基因 orf5878、orf5055和orf5877；其中，orf5878、orf5055和orf5877的DNA序列分 别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0009]进一步说明，所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的氨基酸序列 分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
[0010]进一步说明，所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的克隆方法为： 以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204的基因组为模板，采用PCR扩增方法， 分别获得orf5878、orf5055和orf5877的完整杀虫基因片段。
[0011]进一步说明，所述PCR扩增的引物序列与限制性内切酶包括：
[0012]orf5878引物F：taagaaggagatatacatatgaaaataatgggggaatatatat，R： gtggtggtggtggtgctcgagccaccaaactccctcttttac，限制性内切酶为Nde
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[0013]orf5055引物F：taagaaggagatatacatatgaattcaaatattcaaaattcta，R： gtggtggtggtggtgctcgagccggtaaggtaccaattcaat，限制性内切酶为Nde
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[0014]Orf5877引物F：taagaaggagatatacatatggttactacaaaaatgatacctag，R： gtggtggtggtggtgctcgagaatttgatccgattcgtataact，限制性内切酶为Nde
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[0015]一种芽孢杆菌新菌株HSY204的应用为，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)HSY204在杀伊蚊方面中的应用。
[0016]进一步说明，所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204在制备杀蚊剂中的 应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过对蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)HSY204进行筛选、鉴定、营养期杀虫蛋白的杀虫活性以及其基 因的克隆表达等实验，经过生物活性测定表明，蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)HSY204菌株及其杀虫蛋白对埃及伊蚊幼虫具有很高的毒性，对蚊子的生 长具有明显影响，对小菜蛾和棉铃虫的生长没有影响，可以应用防控蚊虫，有 效降低蚊媒疾病大规模传播的风险。
附图说明
[0018]图1为本专利技术蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204不同视野倍数下的光学 显微镜图；
[0019]图2为本专利技术蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204培养到芽孢期时的不同 视野倍数下的扫描电镜图；
[0020]图3为本专利技术蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204的SDS-PAGE分析，图 中，1：HSY204；2：Bti(Bacillus thuringiensis israelensis)
[0021]图4为本专利技术蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204杀虫基因PCR扩增产物 琼脂糖电泳分析图，图中，A为5877基因；B为5878基因；C为5055基因；
[0022]图5为本专利技术蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204杀虫基因5055、5877、 5878蛋白的SDS-PAGE分析图，图中，A为5877蛋白；B为5878蛋白；C为 5055蛋白。
具体实施方式
[0023]为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步 的说明。
[0024]本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]以下实施例中所用的酶,试剂盒及其他试剂均购自上海生物工程有限公司。
[0026]以下实施例中所用引物由上海生物工程有限公司代为合成。
[0027]实施例1-菌株HSY204的筛选与鉴定
[0028](1)土壤样品采集：采样地点选择在海南省热带雨林，为了增加获取新菌 株的概率，采样点选择植被保护完整、生态环境没有人为干预少、土壤腐殖质 丰富的地方；
[0029](2)菌株HSY204筛选：采用醋酸钠-温度筛选法，称取5g左右土壤放入 20ml BPA培养基中，充分振荡，30℃摇床培养4-5h，75℃水浴15min，取1ml 上清稀释至10-3
、10-4
和10-5
，各吸取200μL NB平板，30℃倒置培养3d，挑取 形态各异的单菌落划平板。
[0030](3)芽孢杆菌培养3-5天形成芽孢后，进一步利用石炭酸复红染色和光学 显微镜分离株的是否含有伴胞晶体蛋白，光学显微镜下观察到无色芽孢为芽孢 杆菌，产生伴胞晶体的芽孢杆菌，命名为蜡样芽孢杆菌HSY204，然后进一步用 电子显微镜观察芽孢的形状，如图1和图2所示，可以出菌和晶体的具体形状。 为了明确筛选得到野生菌株的杀虫活性，以埃及伊蚊作为靶标昆虫进行生物测 定，筛选一株菌株HSY204对伊蚊表现出很好的杀虫效果，命名为蜡样芽孢杆 菌(Bacillus cereus)HSY204。为了进一步鉴定该菌株是否为新型芽孢菌株，通过 SDS-PAGE电泳分析其伴胞晶体带型，发现菌株HSY204与标准菌株有类似的 带，如图3所示。
[0031]实施例2-菌株HSY204的DNA提取及杀虫基因鉴定
[0032]通过利用MiSeq Illumina下一代测序和PacBio技术对菌株HSY204的基因 组序列进行分子和生物信息学分析。
[0033]1.菌株HSY204基因组DNA提取
[0034](1)HSY204单菌落接种于2-5mL左右的LB液体培养基中，28℃，220rpm 培养过夜活化；
[0035](2)第二天按1％量转接到新鲜的LB液体培养基中，28℃，220rpm继续培 养4～6小时至OD600＝2.0左右；
[0036](3)以8000rpm离心2min收集1-3mL菌体；
[0037](4)1mL J Buffer(0.1M Tris HCl(pH 8.0)、0.1M EDTA(pH 8.0)、0.15M Nacl) 洗涤沉淀，8000rpm离心2min，弃上清；
[0038](5)移本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芽孢杆菌新菌株HSY204，其特征在于：其分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO.M2020523。2.如权利要求1所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204包括3个新型杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877；其中，orf5878、orf5055和orf5877的DNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。3.如权利要求2所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。4.如权利要求3所述的一种芽孢杆菌新菌株HSY204的杀虫基因，其特征在于：所述3个杀虫基因orf5878、orf5055和orf5877的克隆方法为：以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HSY204的基因组为模板，采用PCR扩增方法，分别获得orf5878、orf5055和orf5877的完整杀虫基因片段。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文飞，吴江玉，贾璐羽，何佳利，范子钰，蔡雨辰，张旭东，王锐萍，
申请(专利权)人：海口海森元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：