无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用制造技术

本发明专利技术提供了无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用，用无钙镁离子DPBS处理小鼠8细胞胚胎5～10min，削弱了小鼠胚胎卵裂球间的粘性，卵裂球形态微缩，卵周隙明显变大，在进行卵裂球分割时避免了卵裂球活检过程中获取卵裂球操作对其他卵裂球的伤害，胚胎生仔率高，在胚胎活检技术领域具有重要意义。在胚胎活检技术领域具有重要意义。在胚胎活检技术领域具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用


[0001]本专利技术涉及遗传学
，尤其涉及无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用。

技术介绍

[0002]胚胎为多细胞生物由受精卵开始的个体发育过程最初阶段的雏体，卵子在受精后形成受精卵，并开始分裂、发育，形成胚胎。先形成的胚胎为桑椹胚，然后形成囊胚，并且植入在子宫内膜中，吸取母体的营养，继续发育。受精卵发育到桑椹胚这一阶段被称为卵裂期，卵裂期胚胎中的细胞被称为卵裂球。胚胎移植前基因检测(preimplantation genetic diagnosis，PGD)主要应用于临床为辅助生殖的女性提供胚胎活检技术，PGD检测的标本为胚胎卵裂期的1-2个单细胞(卵裂球活检)或囊胚期的几个滋养层细胞(囊胚活检)，用来排除可能携带有遗传疾病的胚胎，选择无遗传疾病的胚胎移入子宫可以有效地防止有遗传疾病的婴儿出生。胚胎分割技术是用人工方法将一个植入前胚胎分割成两个或多个部分，如在卵裂期的卵裂球间分割或将桑椹胚分割，移植后获得同卵双胎或多胎，被广泛用于动物育种、发育遗传学、生理学等领域。胚胎发育过程中卵裂球间的致密化，即卵裂球间连接比较紧密，往往会给PGD检测以及胚胎分割操作带来一定困难。
[0003]为了解决由于卵裂球间紧密连接而引起的操作困难问题，现有技术中通常采用无Ca
2+-Mg
2+
的平衡盐溶液处理，使卵裂球之间连接易于松散，从而利于操作。
[0004]无Ca
2+-Mg
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的PBS溶液常被用于PGD检测和胚胎分割。张敏敏等在激光法活检对小鼠体外受精胚胎后期发育的影响的研究中，将4细胞和8细胞鼠胚放入无Ca
2+-Mg
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的PBS溶液中平衡5min，使胚胎中细胞间连接松散，以便于吸出卵裂球(张敏敏、章志国、周平等，激光法活检对小鼠体外受精胚胎后期发育的影响[J]；安徽医科大学学报，2008，43(001)：13-15.)。韩永胜等在对奶牛的胚胎分割研究中将桑椹胚移入无Ca
2+-Mg
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的PBS溶液中预处理20min，以便于分割操作(韩永胜、佟桂芝、付龙，不同分割液对奶牛不同阶段胚胎分割效果的影响[J]；中国畜牧兽医，2009，36(007)：122-124.)。
[0005]也有研究报道将无Ca
2+-Mg
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的HEPES溶液和无Ca
2+-Mg
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的DPBS溶液用于促进卵裂球之间松散。张宾等在对绵羊体外胚分割研究中将桑葚胚移入无Ca
2+-Mg
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的D-PBS溶液中预处理20min，以降低细胞的连接(张宾、石国庆、唐红，胚胎分割液及分割方法对绵羊体外胚分割效果的影响[J]；新疆农业大学学报，2009，32(04)：41-45.)。李刚在胚胎植入前遗传学诊断的基础及临床应用研究中将6-10细胞期人胚胎置于无Ca
2+-Mg
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的HEPES溶液中处理，以便于后续检测操作(李刚，胚胎植入前遗传学诊断的基础及临床应用研究[D]；郑州大学，2006.)。
[0006]可见现有技术中并没有公开将无Ca
2+-Mg
2+
的DPBS溶液用于卵裂球活检及卵裂球分割，验证低成本的无Ca
2+-Mg
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的DPBS溶液能否适用于卵裂球活检及卵裂球分割，已成为目前亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用，所述无钙镁离子DPBS可以削弱小鼠胚胎卵裂球间的粘性，避免了获取卵裂球操作对其他卵裂球的伤害，提高了胚胎生仔率。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用，所述卵裂球为8细胞胚胎卵裂球；
[0010]所述无钙镁离子DPBS包括：氯化钠5～10g/L、氯化钾0.1～0.5g/L、磷酸氢二钠1～1.5g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、葡萄糖1～2g/L、丙酮酸钠0.01～0.05g/L、青霉素0.05～0.1g/L、硫酸链霉素0.05～0.1g/L、BSA 1～5g/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3～5g/L，余量为水。
[0011]本专利技术中，采用无钙镁离子DPBS处理小鼠8细胞胚胎，削弱了小鼠胚胎卵裂球间的粘性，卵周隙明显变大，分割速度快、损伤率低。
[0012]优选地，所述无钙镁离子DPBS包括：氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.15g、磷酸二氢钾0.2g、葡萄糖1g、丙酮酸钠0.036g、青霉素0.06g、硫酸链霉素0.05g、BSA 3g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5g，余量为水。
[0013]优选地，所述无钙镁离子DPBS的pH为7～7.5，例如可以是7、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。
[0014]第二方面，本专利技术提供了一种小鼠8细胞胚胎卵裂球的获取方法，所述方法包括：
[0015]将获取的8细胞胚胎置于无钙镁离子DPBS中孵育，随后在卵裂球间的透明带上打孔，完成打孔后将活检针从打好的空中插入，吸出卵裂球。
[0016]优选地，所述孵育的时间为5～10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min。
[0017]优选地，所述打孔采用Piezo系统进行。
[0018]优选地，所述活检针的孔径为10～20μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm或20μm。
[0019]优选地，所述8细胞胚胎置于无钙镁离子DPBS中孵育之后，还包括进行酸处理的操作。
[0020]优选地，所述酸处理操作的时间为15～20s，例如可以是15s、16s、17s、18s、19s或20s。
[0021]优选地，所述酸处理采用的酸性液滴包括台氏液(Acid Tyrode's Solution)。
[0022]优选地，所述台氏液的pH为2～3。
[0023]作为优选技术方案，本专利技术提供了一种小鼠8细胞胚胎卵裂球的获取方法，所述方法包括：
[0024](1)将获取的8细胞胚胎置于无钙镁离子DPBS中孵育5～10min，随后置于pH为2～3的台氏酸液滴中孵育15～20s；
[0025](2)将酸处理后的8细胞胚胎置于倒置显微镜中，采用Piezo系统在卵裂球间的透明带上打孔，完成打孔后将孔径为10～20μm的活检针从打好的空中插入，吸出卵裂球。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0027](1)本专利技术采用无钙镁离子DPBS处理小鼠胚胎卵裂球，削弱了小鼠胚胎卵裂球间
3g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5g，溶解于1L水中，pH＝7.4)中孵育10min，之后将胚胎本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.无钙镁离子DPBS在小鼠胚胎卵裂球活检中的应用，其特征在于，所述卵裂球为8细胞胚胎卵裂球；所述无钙镁离子DPBS包括：氯化钠5～10g/L、氯化钾0.1～0.5g/L、磷酸氢二钠1～1.5g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、葡萄糖1～2g/L、丙酮酸钠0.01～0.05g/L、青霉素0.05～0.1g/L、硫酸链霉素0.05～0.1g/L、BSA 1～5g/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3～5g/L，余量为水。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述无钙镁离子DPBS包括：氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.15g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、葡萄糖1g/L、丙酮酸钠0.036g/L、青霉素0.06g/L、硫酸链霉素0.05g/L、BSA 3g/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸5g/L，余量为水；优选地，所述无钙镁离子DPBS的pH为7～7.5。3.一种小鼠8细胞胚胎卵裂球的获取方法，其特征在于，所述方法包括：将获取的8细胞胚胎置于无钙镁离子DPBS中孵育，随后在卵裂球间的透明带上打孔，完成打孔后将活检针从打好的空中...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊平，王红，薛红兰，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：