一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用，属于生物制药技术领域。该类脂肪族聚酮化合物从昆虫内生真菌来源的发酵物中分离纯化得到。该类聚酮化合物对酪氨酸酶具有较强的抑制作用，因此该类脂肪族聚酮化合物可作为酪氨酸酶抑制剂的先导化合物，并在制备酪氨酸酶抑制剂中得到应用。本发明专利技术制备的聚酮化合物，可制备成新型酶抑制剂或先导化合物，克服现有抑制剂低效、副作用大等缺点。本发明专利技术制备的聚酮化合物可以利用微生物进行发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。来源有保证。

【技术实现步骤摘要】
一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物制药
，涉及一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用，具体涉及从一种中国传统药材昆虫鼠妇分离得到共生真菌(Pidoplitchkoviella terricola)的大米固体发酵物中提取的一类聚酮化合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]昆虫共生真菌是指来源于昆虫体表或体内的一类真菌，主要包括虫生病原真菌、虫寄生菌、以及与各种昆虫共生的共生菌。昆虫物种的多样性和分布的复杂性造成了昆虫体内共生菌的多样性，导致其次生代谢产物结构和活性的多样性。目前从昆虫共生菌代谢产物中分离得到的主要结构类型有生物碱、萜类、聚酮、甾体、多肽，同时具有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制、杀虫、抗氧化活性。因此昆虫共生真菌已成为寻找新颖生物活性物质的重要来源之一。
[0003]酪氨酸酶是广泛存在于动植物体内及微生物中的一种含铜离子的氧化还原酶，这类酶具有单酚酶和双酚酶的特性，是合成黑色素及产生色斑的关键酶。酪氨酸酶的代谢功能紊乱会导致雀斑、晒斑、黄褐斑、妊娠斑及老年斑等色素沉着问题的产生。通过抑制酪氨酸酶的催化活性可以抑制黑色素的生物合成，因此，酪氨酸酶抑制剂作为黑色素抑制剂广泛应用于医药、美容和食品等行业。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法及其应用。从华山一只药用昆虫鼠妇(Phlomis umbrosa)的体内分离到真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)的大米固体发酵物中提取到几个具有显著酪氨酸酶活性的脂肪族聚酮化合物和苯并吡喃酮类化合物。本专利技术的目的具体体现在三个方面：
[0005]1.提供具有酪氨酸酶抑制活性的脂肪族聚酮化合物piterrione C；
[0006]2.提供一种提取、分离脂肪族聚酮化合物和苯并α-吡喃酮的方法。
[0007]3.提供聚酮化合物在抑制酪氨酸酶中的应用。
[0008]其技术方案如下：
[0009]一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物，所述化合物是从昆虫内生真菌固体发酵提取物中分离得到的脂肪族聚酮化合物piterrione A-G和苯并-α-吡喃酮化合物，其结构式为：
B(9)(保留时间t
R
＝38.5min)。
[0019]步骤9.对浸膏F6.1用高压液相色谱法(色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4
×
250mm；流动相：甲醇/水＝15/85，流速：2.0mL/min)分离得到piterrione G(保留时间t
R
＝20.3min)。
[0020]进一步，步骤1中，内生真菌的分离、纯化方法具体步骤为：
[0021]先将昆虫体表用无菌水清洗干净，在无菌条件下，无菌水冲洗3min，75％乙醇水溶液冲洗3min，无菌水冲洗3min，置于无菌滤纸上吸干样品表面水分。将表面消毒后的昆虫在研钵中进行研磨，然后吸取1ml混合液与9ml无菌水作为10-1
，装入无菌EP管中。混合均匀后再从中吸取1ml与9ml无菌水作为10-2
，每种浓度取200μL涂布到加入双抗的PD固体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1L蒸馏水上，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到昆虫鼠妇内生真菌。
[0022]进一步，所述昆虫鼠妇内生真菌在PDA平板上，菌落生长缓慢，厚度中等，质地硬实，菌丝不太发达，中间凸起，成熟的菌落为灰黑色，边缘黄棕色，背面土黄色，产生深黄色色素，经形态及分子生物学鉴定为Pidoplitchkoviella terricola。
[0023]本专利技术所述的聚酮化合物在黑色素抑制剂制备过程中的应用。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0025]本专利技术所述聚酮化合物具有显著酪氨酸酶抑制作用，因此可作为一种新型酶抑制剂先导化合物被开发利用。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有下述突出优点：
[0027]1.本专利技术制备的新颖聚酮化合物，可制备成新型酶抑制剂或先导化合物，克服现有抑制剂低效、副作用大等缺点。
[0028]2.本专利技术制备的新颖聚酮化合物可以利用微生物进行发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。
[0030]实施例1：昆虫鼠妇来源内生真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)的分离与纯化
[0031]鼠妇采集于中国陕西省。先将昆虫体表用无菌水清洗干净，在无菌条件下，无菌水冲洗3min，75％乙醇水溶液冲洗3min，无菌水冲洗3min，置于无菌滤纸上吸干样品表面水分。将表面消毒后的昆虫在研钵中进行研磨，然后吸取1ml混合液与9ml无菌水作为10-1
，装入无菌EP管中。混合均匀后再从中吸取1ml与9ml无菌水作为10-2
，每种浓度取200μL涂布到加入双抗的PD固体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1L蒸馏水)上，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后，挑取菌丝纯化培养，得到昆虫鼠妇内生真菌SF13，经分子生物学及形态学鉴定为Pidoplitchkoviella terricola，现保藏在陕西省咸阳市杨凌区西北农林科技大学化学与药学院，保藏编号为SF13，保藏日期为2017年5月17日。
[0032]实施例2：昆虫鼠妇来源内生真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)的固体发酵
[0033]昆虫鼠妇来源内生真菌SF13(Pidoplitchkoviella terricola)，将新鲜的菌体块
接种到1000ml锥形瓶中，每瓶含有400ml的土豆液体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，1L蒸馏水)，共接种140瓶于摇床上，在120rpm、28-30℃条件下发酵7天，然后将发酵液适量接入大米培养基中,在28-30℃条件下静置培养30天。
[0034]实施例3：脂肪族聚酮化合物的提取与分离
[0035]实施例2中所得固体发酵物用甲醇浸泡，浓缩物再用乙酸乙酯萃取五次，真空浓缩干燥得黑色粗浸膏F。对浸膏F进行硅胶柱层析，采用石油醚/乙酸乙酯(50:1，25:1，10:1，5:1，2:1，1:1)和二氯甲烷/甲醇(100:0,100:1,100:2,100:4,100:8,100:16)，得到7个洗脱部分F1-F7。然后对浸膏F1用Sephadex LH-20(甲醇)进行分离，得到F1.1，然后经反相C18(MeOH-H2O,v/v,25％-100％)和半制备液相(CH3CN-H2O,v/v,18:82)得到化合物2(24.3mg)和3(4.2mg)；浸膏F3经硅胶柱层析[CH2Cl
2-MeOH(100:1-100:4,v/v本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物，其特征在于，所述化合物是从昆虫内生真菌固体发酵提取物中分离得到的脂肪族聚酮化合物piterrione A-G和苯并-α-吡喃酮化合物，其结构式为：2.一种具有酪氨酸酶抑制活性的聚酮化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.将从华山捕捉的一只药用昆虫鼠妇中分离、纯化得到昆虫内生真菌的菌块接种到土豆液体培养基中，在120rpm、28-30℃条件下发酵7天，再将培养好的液体发酵液适量倒入大米培养基中，28℃静置培养30天；步骤2.将步骤1所得大米发酵物用甲醇浸泡两次，将真空浓缩干燥后的提取物萃取五次过滤浓缩后，真空浓缩干燥得棕色粗浸膏F；步骤3.对步骤2所得浸膏F进行硅胶柱层析分段，采用50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚/乙酸乙酯和100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16的二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，得到7个组分F1-F7；步骤4.对浸膏F1-F3、F6多次采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20以及反相C-18柱层析分离纯化得到含有7个新化合物的部位F1.1、F2.3、F3.2.2、F3.3.4和F6.1；步骤5.对浸膏F1.1用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4
×
250mm；流动相：乙腈/水＝18/82，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione B保留时间t
R
＝16.5min；piterrione C，保留时间t
R
＝23.0min；步骤7.对浸膏F2.3用高压液相色谱法，色谱柱：EclipseXDB-C18,5μm,9.4
×
250mm；流动相：甲醇/水＝22/78，流速：2.0mL/min，分离得到piterrione E，保留时间t
R
＝38.3min；piterrione F，保留时间t
R
＝52.4min；步骤8.对浸膏F3.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文博，翟怡杰，李剑男，王大成，祁建钊，高锦明，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：