一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法技术

本发明专利技术涉及使用了核酸染料加强型叠氮溴化丙啶(PMAXX)结合实时PCR(real

【技术实现步骤摘要】
一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法


[0001]本专利技术涉及使用了核酸染料PMAXX结合实时PCR(real-time PCR)的检测方法进行酵母活细胞的检测，具体涉及一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法。

技术介绍

[0002]蜂蜜较其他食品而言，具有高糖、高渗透压等性质，因此具有一定的抑制微生物生长的作用，所以蜂蜜中所具有的微生物种类与数量是相对较少的。但是，酵母、霉菌，以及一些能够形成芽孢的细菌，能够在高糖、低水分活度的环境中生存，它们也经常给蜂蜜产业带来问题。蜂蜜中出现的酵母主要有两类:一类为嗜渗酵母(osmophilic yeast)，另一类为耐高渗透压酵母(osmotolerant yeast)，对蜂蜜品质影响都很大。
[0003]蜂蜜中酵母的来源，一般认为分为两部分：一部分是源自花蜜、蜜蜂自身、蜂场的土壤，以及蜂巢的空气等。这类微生物种类繁多，来源复杂，在实际生产中是难以控制的。第二部分，主要是原蜜采集后生产加工过程中引入的，包括生产过程中接触的空气、操作人员、设备和容器等的污染等。这部分污染，是可以通过规范严格的操作来避免的。
[0004]鲁氏接合酵母(Z.rouxii)是蜂蜜中常见的耐高渗透压酵母，常存在于高糖高盐食品中，鲁氏接合酵母通过基因途径或者代谢途径调整细胞壁或细胞质膜的通透性和流动性、以及阳离子的动态平衡、糖的转运、甘油的生物合成与积累途径等，以适应高糖高盐环境。鲁氏接合酵母能引起蜂蜜及其加工产品变质，影响蜂蜜产品的货架期和质量稳定性。
[0005]传统酵母菌鉴定，包括蜂蜜中的鲁氏酵母的鉴定，一般采用传统生化鉴定方法。此方法耗费时间长，且操作步骤繁琐，一般需要1-2周才能完成，并且只能检测出可培养的菌，已经不能满足紧急情况下对蜂蜜及其制品进行灵敏准确的实时质量安全监管的要求。分子生物学技术的发展，为分离自蜂蜜的接合酵母的快速鉴定提供了新的替代方法。实时荧光PCR技术具有快速、灵敏、特异性强等优点，是一种极具优势的分子生物学技术。但是，与大多数传统的核酸检测方法一样，由于DNA在死细胞中能保留较长时间，此鉴定方法并不能区分死菌与活菌，容易出现假阳性结果，从而干扰检测结果。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是建立针对鲁氏接合酵母活细胞的核酸染料结合实时荧光PCR的快速检测方法，极大地缩短了鲁氏接合酵母的检测周期，为蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的快速检测提供了一种比较有应用前景的方法，以及为蜂蜜产品的质量控制提供技术支持。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采用以下技术手段：
[0008]一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将待测样品分为若干份，离心后收集沉淀，在沉淀中加入无菌水获得菌悬液，使用核酸染料处理菌悬液，并进行曝光处理后提取DNA，采用荧光定量PCR扩增，获取Ct值，从扩增曲线上得到待测样品中鲁氏接合酵母活细胞的浓度。
[0009]进一步的，所述核酸染料为加强型叠氮溴化丙啶(PMAXX)，其添加浓度范围为
20.00-120.00μmol/L；当细胞浓度为1.0
×
108CFU/mL时，其添加浓度为76.92μmol/L。
[0010]进一步的，所述检测方法具体为：
[0011](1)处理待测样品：取待测样品分为4份，每份500μL，分别装入2mL离心管中，加入1mL无菌水充分混匀洗涤后离心(12000转/分钟
×
3分钟)，收集沉淀，再加入500μL无菌水,混匀，分为实验组E与对照组C，每组两管；
[0012](2)处理对照组：将C组中的菌悬液在恒温混匀仪中于90℃下热处理20min；
[0013](3)核酸染料PMAXX处理：向E组和C组的菌悬液内均添加浓度为2mmol/L的PMAXX溶液，至PMAXX终浓度范围为20.00-120.00μmol/L，混匀，暗处理10～30min，将E、C两组离心管转移至冰上，再使用650w的卤素灯，照射10min
×
2次，离心收集沉淀；
[0014](4)提取DNA：用基因组DNA提取试剂盒提取步骤(3)中所得的沉淀菌体的DNA，检测提取的DNA的浓度和质量，调整DNA模板浓度一致；
[0015](5)荧光定量PCR扩增，扩增体系总体积20μL，含有10μL实时荧光PCR反应预混液和正向引物、反向引物各0.2μmol/L、探针0.1μmol/L，DNA模板1-50ng，扩增条件为：在95℃预变性10mim，然后进行40个循环的95℃变性15秒、60℃退火60秒，每个样品重复2次，获得Ct值，根据Ct值，从标准曲线上查出样品中鲁氏接合酵母活细胞的浓度。
[0016]进一步的，选择核酸染料和确定优化浓度的方法如下：
[0017](1)培养菌株：将鲁氏接合酵母标准菌株接种在麦芽浸粉琼脂(MEA)斜面培养基上，并于28℃培养箱中培养36小时；
[0018](2)配制菌悬液：将MEA斜面培养基上的鲁氏接合酵母用无菌水冲洗，调整菌体浓度为1.0
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108CFU/mL,并以500μL/管分装在42个离心管中，分为实验组E1组和对照组C1组，每组各9份菌悬液；以及实验组E2组和对照组C2组，每组各12份菌悬液；
[0019](3)处理对照组：将C1和C2组中的菌悬液在恒温混匀仪中于90℃下热处理20min；
[0020](4)核酸染料处理：分别向E1组和C1组中的菌悬液中添加2mmol/L的PMA溶液，得到PMA终浓度分别为0、19.80、27.61、31.50、39.22、58.25、76.92、113.21、148.15μmol/L的菌悬液；分别向E2组和C2组中的菌悬液中添加2mmol/L的PMAXX溶液，得到PMAXX终浓度分别为0、2.00、2.80、3.99、23.72、27.61、31.50、39.22、58.25、76.92、113.21和148.15μmol/L菌悬液，将上述菌悬液混匀，暗处理10～30min，将四组离心管均转移至冰上，再使用650w的卤素灯，照射10min
×
2次，离心收集沉淀；
[0021](5)提取DNA：用基因组DNA提取试剂盒提取步骤(4)中所得的沉淀菌体的DNA，检测提取的DNA的浓度和质量，调整DNA模板浓度一致；
[0022](6)荧光定量PCR扩增，扩增体系总体积20μL，含有10μL实时荧光PCR反应预混液和正向引物、反向引物各0.2μmol/L、探针0.1μmol/L，DNA模板1-50ng，扩增条件为：在95℃预变性10mim，然后进行40个循环的95℃变性15秒、60℃退火60秒，每个样品重复2次，获得Ct值；
[0023](7)核酸染料的选择和确定优化浓度：根据E1、C1组，以及E2、C2组的Ct值，计算出的ddCt值，ddCt的计算公式为：ddCt＝dCt(死细胞)
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dCt(活细胞)，dCt(死细胞)＝Ct(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：将待测样品分为若干份，离心后收集沉淀，在沉淀中加入无菌水获得菌悬液，使用核酸染料处理菌悬液，并进行曝光处理后提取DNA，采用荧光定量PCR扩增，获取Ct值，从扩增曲线上得到待测样品中鲁氏接合酵母活细胞的浓度。2.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法，其特征在于，所述核酸染料为加强型叠氮溴化丙啶(PMAXX)，其添加浓度范围为20.00—120.00μmol/L；当细胞浓度为1.0
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108CFU/mL时，其添加浓度为76.92μmol/L。3.根据权利要求2所述的一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体为：(1)处理待测样品：取待测样品分为4份，每份500μL，分别装入2mL离心管中，加入1mL无菌水充分混匀洗涤后离心(12000转/分钟
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3分钟)，收集沉淀，再加入500μL无菌水,混匀，分为实验组E与对照组C，每组两管；(2)处理对照组：将C组中的菌悬液在恒温混匀仪中于90℃下热处理20min；(3)核酸染料PMAXX处理：向E组和C组的菌悬液内均添加浓度为2mmol/L的PMAXX溶液，至PMAXX终浓度范围为20.00—120.00μmol/L，混匀，暗处理10～30min，将E、C两组离心管转移至冰上，再使用650w的卤素灯，照射10min
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2次，离心收集沉淀；(4)提取DNA：用基因组DNA提取试剂盒提取步骤(3)中所得的沉淀菌体的DNA，检测提取的DNA的浓度和质量，调整DNA模板浓度一致；(5)荧光定量PCR扩增，扩增体系总体积20μL，含有10μL实时荧光PCR反应预混液和正向引物、反向引物各0.2μmol/L、探针0.1μmol/L，DNA模板1-50ng，扩增条件为：在95℃预变性10mim，然后进行40个循环的95℃变性15秒、60℃退火60秒，每个样品重复2次，获得Ct值，根据Ct值，从标准曲线上查出样品中鲁氏接合酵母活细胞的浓度。4.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中鲁氏接合酵母活细胞的检测方法，其特征在于，选择核酸染料和确定优化浓度的方法如下：(1)培养菌株：将鲁氏接合酵母标准菌株接种在麦芽浸粉琼脂(MEA)斜面...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈世琼，穆同娜，刘艳琴，王丹，蔡雪凤，任岩，刘凯，巩有博，李黎，冯贺琪，吴莹莹，
申请(专利权)人：北京市食品安全监控和风险评估中心北京市食品检验所，
类型：发明
国别省市：