在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法技术

一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法，所述方法为将原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度下培养的方法。或低氧气浓度下培养的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法


[0001]本专利技术涉及一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法。本申请主张基于2018年6月21日在日本申请的特愿2018-117988号的优先权，在此引用其内容。

技术介绍

[0002]生物体内存在构成身体的体细胞以及将遗传讯息传递至下一世代的生殖细胞。尤其，雌性生殖细胞的卵子是在完成早期发育中扮演重要角色的细胞。哺乳类中的雌性生殖细胞的经历为，在胚胎期时原始生殖细胞增殖，而后进入减数分裂，大部分的细胞几乎在出生同时死亡。残存的卵母细胞同时形成原始卵泡以及周围的颗粒细胞。此种雌性生殖细胞为，在胚胎期的原始生殖细胞达到高峰并减少，出生后维持有限数量的卵母细胞，并且通过使一部分细胞周期性活化以维持排卵周期。此种排卵周期的起点为原始卵泡，卵母细胞以受一层扁平状颗粒细胞包围的状态存在于卵巢皮质。并且，在排卵周期中，原始卵泡发育为初级卵泡、次级卵泡、囊状卵泡、格拉夫氏卵泡(成熟卵泡)，并且排卵。然而，目前不知道原始卵泡的维持以及活性化机制的全貌。因此，确立从原始生殖细胞分化为原始卵泡的体外培养法，可能是解析原始卵泡的维持以及活性化机制的方法。进一步地，若能确立此种培养法，则可以在生体内以及体外持续性地形成卵子。
[0003]近年来，确立了从原始生殖细胞分化为功能性成熟卵母细胞的培养方法(举例而言，参照专利文献1以及非专利文献1)。
[0004]【
技术介绍
文献】
[0005]【专利文献】
[0006]【专利文献1】国际公开第2017/047799号
[0007]【非专利文献】
[0008]【非专利文献1】Morohaku K.et al.，
″
Complete in vitro generation of fertile oocytes from mouse primordial germ cells.
″
，Proc Natl Acad Sci，Vol.113，No.32，p9021-9026，2016.

技术实现思路

[0009]然而，在专利文献1以及非专利文献1记载的方法中，并未确认原始卵泡的形成，且功能性卵子的形成是瞬间性的。
[0010]本专利技术是鉴于上述事项而完成，且提供一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法。
[0011]专利技术人为了达成上述目的而努力进行研究的结果，发现通过在加压条件或低氧气浓度条件下培养原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞，可以形成原始卵泡，据此完成本专利技术。
[0012]此即，本专利技术包含以下样态。
[0013]根据本专利技术的第1样态的方法为一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方
法，所述方法为将原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度下培养的方法。
[0014]在根据上述第1样态的方法中，所述培养可以在加压条件下以及低氧气浓度下进行。
[0015]在根据上述第1样态的方法中，所述培养可以在PI3激酶抑制剂存在下进行。
[0016]在根据上述第1样态的方法中，所述PI3激酶抑制剂可以为Y294002。
[0017]在根据上述第1样态的方法中，所述培养可以在排除雌性激素或与所述雌性激素具有类似功能的因子的条件下进行。
[0018]在根据上述第1样态的方法中，所述低氧气浓度条件可以为，在培养环境中的氧气浓度在7％以下的条件。
[0019]在根据上述第1样态的方法中，所述低氧气浓度条件可以为，在培养环境中的氧气浓度在3％以上7％以下的条件。
[0020]在根据上述第1样态的方法中，所述加压条件可以为，23kPa以上40kPa以下的条件。
[0021]在根据上述第1样态的方法中，所述加压条件可以为，28kPa以上38kPa以下的条件。
[0022]在根据上述第1样态的方法中，获得的所述原始卵泡可以满足以下的(1)以及(2)的条件：
[0023](1)卵母细胞受扁平状的颗粒细胞包围；
[0024](2)在所述卵母细胞的细胞核内，局部存在具有将卵泡的成熟维持在休止期的功能的转录因子。
[0025]在根据上述第1样态的方法中，所述转录因子可以为Foxo3a。
[0026]在根据上述第1样态的方法中，获得的所述原始卵泡可以进一步满足以下的(3)的条件：
[0027](3)直径为20μm以下。
[0028]【专利技术的效果】
[0029]根据上述样态的方法，可以在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡。
附图说明
[0030]【图1】a～d为在参考例1中，出生后3.5日龄的雌性小鼠的生殖腺切片的免疫染色图。比例尺为10μm。a为使用针对生殖细胞标记的小鼠Vasa同源物(Mouse Vasa homolog，MVH)的抗体的免疫染色图。b为使用针对细胞外基质的纤粘蛋白的抗体的免疫染色图。c为使用与应力纤维的纤维状肌动蛋白(F-actin)特异性结合的Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽(Phalloidin)的免疫染色图。并且，d为将通过4
′
，6-二脒基-2-苯基吲哚(4
′
，6-diamidino-2-phenyl-indole，DAPI)的细胞核染色图叠加在a～c的免疫染色图上的图像。并且，a
′
～d
′
各自为a～d内以四角形框起部分的放大图。比例尺为10μm。e～h为在参考例1中受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺切片的免疫染色图。比例尺为10μm。e为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。f为使用针对细胞外基质的纤粘蛋白的抗体的免疫染色图。g为使用针对应力纤维的纤维状肌动蛋白(F-actin)的抗体的免疫染色图。并且，h
为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a～c的免疫染色图上的图像。并且，e
′
～h
′
各自为e～h内以四角形框起部分的放大图。
[0031]【图2】a～c为在实施例1中，将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在加压条件下培养，且从开始培养的第21日采集的生殖腺切片的免疫染色图。a为使用针对生殖细胞标记的MVH的抗体的免疫染色图。b为使用针对转录因子Foxo3a的抗体的免疫染色图。c为将通过DAPI的细胞核染色图叠加在a以及b的免疫染色图上的图像。比例尺为10μm。
[0032]【图3】在实施例1中，将受精后12.5日龄的雌性小鼠的生殖腺在常态状态(控制组，Control)以及在加压条件下(Pressured)培养，在开始培养第21日采集的生殖腺切片通过萤光立体显微镜的影像。通过在卵母细胞标记Stella的表现调控下表现的青色萤光蛋白质(cyan fluorescent protein，CFP)的萤光，使卵母细胞可视化。比例尺为50μm。
[0033]【图4A】在实施例1中，在生理食盐水(PBS)、蛋白质分解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在体外将原始生殖细胞分化为原始卵泡的方法，其特征在于，所述方法为将原始生殖细胞以及邻接于所述原始生殖细胞的支持细胞在加压条件下或低氧气浓度下培养的方法。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养是在加压条件下以及低氧气浓度下进行。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养是在PI3激酶抑制剂存在下进行。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PI3激酶抑制剂为Y294002。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养是在排除雌性激素或与所述雌性激素具有类似功能的因子的条件下进行。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述低氧气浓度条件为，在培养环境中的氧气浓度在7％以下的条件。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述低氧气...

【专利技术属性】
技术研发人员：永松刚，西村洋平，岛本走，林克彦，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，
类型：发明
国别省市：