hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立制造技术

本发明专利技术涉及干细胞治疗技术领域，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）,人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理标准优化和体系建立；MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用。根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立原辅料控制、脐带接收控制及间充质干细胞胞制剂控制的质量标准。本发明专利技术优化并建立了工艺和质量标准，提高了产量，为临床应用，实现工业化生产创造了条件。造了条件。

【技术实现步骤摘要】
hMSC生产试剂盒开发和质量管理标准优化和体系建立


[0001]本专利技术涉及干细胞治疗
，具体涉及一种优化的从胎儿附属物（脐血、脐带、胎盘等）、毛囊、脂肪和牙髓等中分离间充质干细胞（MSC）,人间充质干细胞（hMSC）工业化生产体系和质量管理标准优化和体系建立； MSC扩增培养试剂盒和鉴定试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]人间充质干细胞(human MSCs, hMSCs)是一类具有一定的自我复制更新和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于胎儿和成人各组织中，如骨髓、脂肪、皮肤、牙髓、肌腱，以及新生儿附属组织，如脐带、胎盘、羊膜等组织。除一定程度的分化潜能外，hMSCs还具有独特的免疫调控和组织再生功能，参与调控异常免疫反应、维护免疫平衡，帮助机体形成有利于病损组织细胞修复或再生的微环境，以促进损伤组织细胞的修复或再生。
[0003]hMSCs独特的生物学功能决定了其应具有广泛的临床适应症，并使其成为近十年来细胞治疗领域中发展最为广泛、最为迅速的干细胞类型。过去10年来所积累的大量临床前及临床研究数据显示，不同组织来源的hMSCs均具有不同程度，针对不同临床适应症的治疗效果。目前在clinicaltrial.gov登记的各种自体或异体组织来源的hMSCs临床适应症类型或疾病亚型已有上百种，其中常见的临床适应症类型包括骨关节疾病、心血管疾病、器官功能衰竭、神经退行性疾病、移植物抗宿主病、多发性硬化、脊髓损伤、炎性结肠炎、脊髓侧索硬化、系统性红斑狼疮等。
[0004]然而，无论是临床前或临床研究阶段，现有的研究结果仍都存在不同程度的问题，而所有问题又都不同程度地汇聚到hMSCs的质量问题上。其中临床前研究所表现的问题是，不同研发者所使用的hMSCs来源、培养体系、制备工艺、质量标准、评价技术等存在很大差异，也存在质量评价内容和评价技术的合理性等问题，很难形成相对统一的质量标准；临床研究阶段细胞质量的稳定性研究欠缺，细胞质量评价和受试者评估体系尚未建立等。
[0005]类似于所有治疗性细胞产品，hMSCs代表着人类医药发展史上最为复杂的医药产品，具有传统医药产品难以比拟的多样性、变异性、复杂性和不稳定性等质量特性。为了有效保障包括hMSCs在内的所有治疗性细胞的质量，为其标准化使用建立标准和规范化管理体系，hMSCs具备基本细胞生物学属性、微生物学安全性、生物学安全性及生物学有效性“四大类”质量属性。这“四大类”质量属性，是质量标准、质量体系建立的对象，是临床前研发阶段首要解决的关键问题，也是整个细胞产品研发周期全质量要素的基础。
[0006]在临床应用中，MSC细胞培养过程中采用的试剂较多，标准不一致，培养过程中工作量大，培养时间长，工艺繁琐，不稳定，染菌风险大，细胞质量标准难以控制，难在短时间内培养出质量均一的MSC细胞，迫切需要开发简单、格式化的试剂盒，本专利技术提供一种MSC细胞培养添加剂MSC
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，对添加剂的配方进行了优化，使MSC增殖能力提高10-20%，同时优选了血清，使生产成本降低50%，本专利技术改进了工艺，这对获得大量间充质干细胞，满足临床试验，实现工业化生产具有重要的意义；同时本专利技术优化了脐带原代组织处理工艺，组织块贴壁率达到95%以上，原代细胞得率提高10倍；优化了传代培养工艺，用预传代细胞的培养上
清液终止消化，防止细胞出现损伤性拉丝，使显微镜下视野中细胞拉丝率降低至1%以下，传代细胞扩增倍数由5倍提高至10倍，提高了细胞产量，由于细胞上清液是废液，用来终止消化，降低了原材料消耗和生产成本。

技术实现思路

[0007]根据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（试行）、《细胞制品研究与评价技术指导原则》(征求意见稿)以及2015版《中国药典》通则9203——药品微生物实验室质量管理指导原则所规定的内容，建立原辅料控制、脐带接收控制及间充质干细胞胞制剂控制的质量标准。
[0008]本专利技术是通过以下步骤得到的：1. 产妇脐带捐献准入标准：无家族性遗传病及病原微生物感染，知晓并签署知情同意书；运输过程：脐带采集管完全密封，运输温度为4℃-25℃；运输时间不应超过24h传染病检测：母血或脐血TP /HIV/HBV/HCV/HCMV/EBV/HPV/HHV阴性；储运液取样细菌培养无菌、支原体检测阴性；母血无凝块、溶血及重度乳糜，储存容器无破损；无母血脐带中可留少量脐血；脐带标准：重量≥15g，形态饱满呈乳白色2. 种子细胞库控制培养液澄清，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，P2代种子细胞入种子细胞库前取500ul做内毒素检测，10
6-107细胞做流式检测，上清和细胞悬液留样，留样样本按照编码规格进行编号；3. 工作细胞库控制种子细胞复苏，传代培养，待培养至P5代细胞长到80-90%融合时，收获细胞，即为工作细胞库，细胞长梭形涡旋状排列，细胞融合度达80%，细胞数量≥1
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109，细胞活率≥90%，P5代工作细胞收获时各取1ml做内毒素检测、真菌和细胞内外病毒因子检测，第二次离心后取20ml上清做菌检、 BSA残留量检测、抗生素残留量检测、EGF、bFGF残留量和支原体检测，P5代细胞入工作细胞库待检区，上清和细胞悬液留样各四份，留样样本按照编码规格编号；4. 冻存装置完全密封，细胞编号、类型、冻存日期标记完整清晰，保存位置明确；冻存过程：程序降温；5. 复苏过程：37℃快速复苏；6. MSC细胞制剂出库控制标准：细胞数量达标，细胞活率≥90%，内毒素检测阴性；取适量细胞用适量生理盐水悬浮，添加人血白蛋白浓度至3%，经细胞筛过滤。采用生理盐水袋或专用容器灌装，终体积可根据要求适当选择（5～80）ml，细胞制剂进行细胞数量、活率、内毒素检测。细胞制剂留样4份，留样样本按照编码规则编号。
[0009]质保部人员负责做好对细胞制剂出库的审核与质量监督，细胞制剂接收人即为细胞制剂运输人，负责再次确认、接收出库细胞制剂，并放置进保温血箱，保证细胞制剂安全
存放（4～25℃），避光保存和运输，直至运达目的地，自生产之时起，有效期为12小时。
[0010]本专利技术提供一种MSC制备试剂盒，包括容器和装入容器中的临床用MSC细胞扩增培养液MSC-、细胞培养添加剂MSC-。本专利技术提供一种临床用MSC细胞扩增基础培养液MSC
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，PH7.2～7.4，平衡盐Earle
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s 盐 、核苷、L-谷氨酰胺2mM、NaHCO3 2200mg/L、D-葡萄糖 1000mg/L、丙酮酸钠 1mM、酚红指示10mg/L、无机盐、氨基酸、维生素、核糖核苷、脱氧核糖核苷等，使用时添加2mM GlutaMAX
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I和10%Prime FBS，本专利技术不排除可以采用上述培养基之外的培养基实施培养。
[0011]本专利技术提供一种MSC细胞培养添加剂MSC-，其中含有2-50ng/mL bFGF和2-50ng/ml EGF；优选的[0012]中，3-20ng/mL bFGF、3-20n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
EGF；优选的[0012]中，3-20ng/mL bFGF、3-20ng/ml EGF；MSC按照细胞密度8-10
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103/cm2用完全培养液重悬；所述完全培养液的配制：MSC
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中添加1/1000 MSC-、2mM GlutaMAX
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I和10%Prime FBS；（3）一种hMSC鉴定试剂盒，所述临床用MSC细胞流式表型和活性鉴定试剂盒包括五组双色抗体组合物，分别是IgG-Percp-cy5/CD105-PE/CD73/CD90、CD44-PE和Annexin-FINKTC/PI，洗涤液50ml一管，固定液50ml一管；每5-10ul可检测一次，共计50套，所述洗涤液是磷酸盐缓冲液；所述固定液是1%多聚甲醛；（4）本发明还包括将上述hMSC培养试剂，MSC细胞扩增培养液MSC
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、细胞培养添加剂MSC-和鉴定试剂装入专用洁净容器制备成试剂盒。2.应用权利要求1所述的hMSC工业化生产和质量管理体系标准和试剂盒制备hMSC，其特征在于，包括以下步骤：脐带间充质干细胞的分离和培养方法：（1）hMSC细胞培养添加剂MSC-配置，其中含有2-50ng/mL bFGF和2-50ng/ml EGF；（2）配置完全培养液的配制：MSC
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中添加1/1000 MSC-、2mM GlutaMAX
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I和10%Prime FBS，取10ml包被150cm培养皿；（3）用尖头直剪将脐带剪成约2cm长度的小段，至少清洗3次，取最后一次清洗液20ml做菌检；（4）转移脐带组织至一新的培养皿中，将脐带一端沿静脉腔内剪个切口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，用组织镊去除羊膜，小心地将1根静脉血管和2根动脉血管剖离，翻转脐带，撕去上皮，得到的华通氏胶用手术刀切成边长 3-5mm 之间的小块，将 3-5mm 之间的组织小块均匀的种植在150cm培养皿中，组织块之间的间距为 1cm左右，放入培养箱中，48H后补液至30ml，至第七天静止不动；（5）第七天全量换液，经过11-15天的原代培养，收获原代MSC细胞，P0细胞数量达到约1x107，P0传P1代，细胞扩增倍数不应低于7倍，低于7倍说明原代细胞有老化现象；（6）细胞分为种子细胞库和工作细胞库二级库，传至P2代时收获种子细胞，内毒素和流式表型检测合格后入种子细胞库；（7）传代培养至P5代工作细胞入待检区，待细胞数量、活性、表型、内毒素、真细菌、支原体、STR分型检测、核型分析、细胞内、外病毒因子检测和诱导分化能力检测合格后入工作细胞库；（8）质量检测合格的hMSC细胞装入50-100ml生理盐水中，制成干细胞细胞制剂，配合临床治疗需要使用。3.根据权利要求2所述的脐带原代细胞制备，其特征在于步骤（2）hMSC完全培养液中血清优选为Prime血清，降低生产成本；步骤（3）中组织块大小3-5mm，均匀的种植在150cm培养皿中，48...

【专利技术属性】
技术研发人员：路春光，
申请(专利权)人：路春光，
类型：发明
国别省市：