BRAF制造技术

本发明专利技术提出一种BRAF

【技术实现步骤摘要】
BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒和BRAF
V600E
突变比例检测方法。

技术介绍

[0002]BRAF基因所编码的丝/苏氨酸特异性激酶是Ras-Raf-MEK-ERK通路中关键激酶，通过激活下游底物MEK发挥信号传导调节作用。通常BRAF蛋白只在传递信号时保持激活状态，但突变的BRAF蛋白则被持续性激活。BRAF被认为是多种肿瘤发生的驱动基因，其突变导致上述通路异常激活可使多种突变细胞发生肿瘤转化。BRAF最常见突变形式为第l799位核苷酸T/A突变，导致谷氨酸(V)替换为缬氨酸(E)，约占BRAF基因突变的97％，命名为BRAF
V600E
。近年，许多学者在朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans Cell Histiocytosis，LCH)患者病灶样本中重复检测到BRAF基因突变，并认为该突变是LCH发病驱动因子。LCH是一组来源于骨髓的朗格汉斯细胞异常增生，伴有数量不等的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞及多核巨细胞浸润，引起组织破坏。该病在低龄儿童发病率较高，轻者仅累及皮肤，重者可累及多器官并造成重要脏器功能损害，未经治疗的LCH患者病死率高达92.1％。另外，多项研究证实，恶性黑色素瘤、毛细胞白血病、甲状腺乳头状癌、结肠癌等人群中均存在高频率BRAF
V600E
突变。因此，BRAF
V600E
突变检测不仅可以进行肿瘤早筛，肿瘤患者危险分层，更为BRAF突变肿瘤患者靶向药物使用提供指导。
[0003]目前，BRAF
V600E
突变检测主要通过qPCR、一代或二代测序完成，检测准确性与灵敏度较差。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒和BRAF
V600E
突变比例检测方法，旨在提高对BRAF
V600E
突变比例检测的准确性与灵敏度。
[0005]为实现上述目的，第一方面，本专利技术提出一种BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒，包括：
[0006]引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0007]引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0008]探针一，包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团；以及
[0009]探针二，包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团。
[0010]可选地，所述核苷酸序列一的5
’
端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3
’
端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5
’
端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列二的3
’
端连接MGB淬灭基团。
[0011]第二方面，本专利技术还提出一种BRAF
V600E
突变比例检测方法，包括以下步骤：
[0012](1)获得待测样品，并提取待测样品的ctDNA；
[0013](2)利用引物一、引物二、探针一和探针二，以步骤(1)中获取的所述ctDNA为模板，进行数字PCR扩增，并扫描FAM与HEX通道荧光信号；
[0014](3)利用步骤(2)中FAM与HEX通道的荧光信号，计算不同通道的核酸拷贝数，获得基因位点的突变比例；
[0015]其中，所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针一包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团；所述探针二包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团。
[0016]可选地，所述核苷酸序列一的5
’
端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3
’
端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5
’
端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列二的3
’
端连接MGB淬灭基团。
[0017]本专利技术提出的BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒和BRAF
V600E
突变比例检测方法，针对ctDNA样本开发，并基于数字PCR，可以克服肿瘤异质性，并有效检测BRAF
V600E
低至0.01％的突变，显著提高了检测的灵敏度与准确性，具有特异性强、灵敏度高、实用性强的特点，可以实现肿瘤基因筛查，指导肿瘤患者靶向药物应用，肿瘤患者微小残留病的监测。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0019]图1为实施例一中本专利技术对BRAF
V600E
突变比例标准品的检测结果；
[0020]图2为实施例一中本专利技术检测结果与标准品突变比例的相关性分析图；
[0021]图3为实施例三中部分BRAF
V600E
突变阳性临床样本ctDNA的提取结果；
[0022]图4为实施例三中本专利技术与二代测序检测结果的相关性分析图。
[0023]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0024]下面通过实施例对本专利技术作进一步的详细说明，旨在用于说明本专利技术而非限定本专利技术。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本专利技术的保护范围之内。
[0025]本专利技术提出一种BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒，包括引物一、引物二、探针一以及探针二；所述引物一的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物二的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针一包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团；所述探针二包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5
’
端的荧光基团和3
’...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒，其特征在于，包括：引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；探针一，包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团；以及探针二，包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5
’
端的荧光基团和3
’
端的淬灭基团。2.如权利要求1所述的BRAF
V600E
突变比例检测试剂盒，其特征在于，所述核苷酸序列一的5
’
端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3
’
端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5
’
端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列二的3
’
端连接MGB淬灭基团。3.一种BRAF
V600E
突变比例检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)获得待测样品，并提取待测样品的ctDNA；(2)利用引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，杜可明，袁志阳，徐祥，邵文涵，
申请(专利权)人：上海荻硕贝肯医学检验所有限公司上海荻硕贝肯生物科技有限公司上海荻硕贝肯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：