注射用银耳孢糖免疫佐剂的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种注射用银耳孢糖及其提取纯化方法以及应用。所述注射用银耳孢糖单糖组成比例为甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：岩藻糖＝66.2：10.75：1.12：19.20：2.82。所述注射用银耳孢糖的提取纯化方法包括银耳孢糖以水溶解后，通过活性炭柱柱层析，醇沉，盐酸水解，氢氧化钠中和后再次以醇沉，制得注射用银耳孢糖。制备得到的注射用银耳孢糖具有分子量较小、纯度高、水溶性好的特点。本发明专利技术的注射用银耳孢糖具有良好的免疫增强活性，可以作为佐剂，明显提高多种疫苗的免疫原型，应用在多种疫苗的制备中。疫苗的制备中。

【技术实现步骤摘要】
注射用银耳孢糖免疫佐剂的制备方法及其应用


[0001]本专利技术是关于注射用银耳多糖作为免疫佐剂在医药产品中的用途。属于生物药学


技术介绍

[0002]免疫佐剂为与抗原一起或预先注入机体时可有效增强免疫应答的强度或改变免疫应答的类型的非特异性免疫增强剂。常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂；微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)等；近年来，由植物或微生物来源的多糖类成分也成为了研发新型佐剂的成分，如海带多糖。免疫佐剂的生物作用包括：改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原。对新的免疫佐剂的筛选和开发，越来越引起人们的重视。
[0003]银耳(Tremella fueiformis Berk)又名白木耳，为担子菌纲银耳科银耳的干燥子实体，为常用保健药品，具有滋阴润肺的功效，已有几百年的药用历史。其主要化学成分为多糖类化合物。还含有脂类、蛋白类(酶、蛋白质、氨基酸)、无机盐、维生素B族等。银耳多糖主要为酸性杂多糖，是由分子量由几万到几十万的系列酸性杂多糖构成；其组成糖为木糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸；大量的化学和药理实验证明，银耳多糖具有明显的抗辐射,升高白细孢、降血糖、抗溃疡、增强免疫、抗肿瘤、对抗放化疗的毒副作用等活性；急性毒性和长期毒性研究表明，该多糖口服或注射给药均未见明显的毒副作用。银耳多糖易溶于热水，稍溶于低浓度的乙醇，不溶于高浓度的乙醇等有机溶剂，其水溶液成透明粘稠状。银耳多糖在体内的吸收、分布和代谢研究结果表明，其口服吸收利用率极低(＞1％)，肌肉注射和静脉给药时银耳多糖提高免疫功能、升白、抗癌的作用明显高于口服给药。由于其口服生物利用率低，作用不明显，作为新药研发时，应选择注射给药的途径。但由于银耳多糖分子量大，结构复杂，其水溶液还具有一定的粘稠性，影响它作为注射剂应用，也影响对其质量的评价、控制和大规模生产。因此对其进行降解，制备结构相对简单、分子量小、水溶性好的片段，从中筛选得到作用更强的活性部位，对其开发和应用具有重要的意义。
[0004]本专利技术完成前未发现有关注射用银耳多糖作为免疫佐剂的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的之一在于提供一种免疫佐剂，其是以天然多糖与流感疫苗配合使用，能够增强机体免疫功能。
[0006]本专利技术对银耳孢糖经分离纯化、降解后，制备了分子量较小、纯度高、收率高的注射用银耳孢糖。注射用银耳孢糖在提高机体的免疫功能等方面具有明显的作用；同时由于
良好的水溶性，也可满足作为注射方式给药的要求，首次应用于免疫增强剂及疫苗的佐剂具有明显的技术创新。
[0007]优选地，所述疫苗为H5N1流感疫苗及狂犬疫苗。
[0008]本专利技术的有益效果在于：本专利技术以天然银耳多糖作为活性成分，与流感疫苗配合使用，在效果上起协同作用，可增强流感疫苗的活性，获得理想的免疫效果。
[0009]具体来说，采用本专利技术的免疫佐剂的流感疫苗在整个免疫周期内，相比于没有添加免疫佐剂的流感疫苗，其免疫表达的抗体滴度会显著提高。
[0010]本专利技术另一目的，提供注射用银耳孢糖的制备方法：
[0011]a.取银耳孢糖，加纯净水，40℃条件下搅拌8小时后，离心，收集离心液，通过颗粒活性碳柱,收集洗脱液，浓缩至每ml含0.3g银耳孢糖，放置至室温，搅拌条件下，缓缓加入1.6倍量95％乙醇，继续搅拌20分钟，离心，收集离心液，搅拌条件下继续加入10倍量95％乙醇，继续搅拌20分钟，离心，收集沉淀，自然干燥，得粗多糖；
[0012]b、取粗多糖粉末，加入20倍量盐酸水溶液，在90℃水浴中水解，水解结束取出放置至室温，滴加氢氧化钠水溶液调pH至中性，搅拌条件下，加入0.5倍量95％乙醇，继续搅拌2小时，离心，收集沉淀，加入10倍量注射用水溶解，用微孔滤膜滤过，冷冻干燥，得注射用银耳孢糖。
[0013]如上所述注射用银耳孢糖的制备方法，其特征在于，步骤a银耳孢糖与蒸馏水料液比为为1：20g/mL，搅拌时转速为500rpm。
[0014]如上所述注射用银耳孢糖的制备方法，其特征在于，步骤b盐酸水溶液浓度为0.1mol/L，水解时间为4-10小时。
[0015]为了实现以上
技术实现思路
，通过以下技术方案进行：
[0016]1、注射用银耳孢糖理化性质的测定
[0017]1.1中性糖含量测定
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苯酚-硫酸法
[0018]取注射用银耳孢糖100mg，加水50ml溶解，取1ml，以中国药典2000版一部附录IX S测定，注射用银耳多糖以甘露糖计，不低于75％。
[0019]1.2糖醛酸含量测定
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间-羟基联苯法
[0020]1.2.1对照品溶液的制备
[0021]精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖醛酸对照品5mg，置100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含葡萄糖醛酸50μg)。
[0022]1.2.2标准曲线的制备
[0023]精密吸取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml，分别加水补充体积至0.4ml混匀，在冰水浴中加入2.4ml 0.0125mol/L四硼酸钠—硫酸溶液(取四硼酸钠0.475克，加浓硫酸100ml溶解)，混匀，在沸水浴中加热5分钟，取出并迅速冷却至室温，加入0.15％间羟基联苯40μl，立即混匀，以0管为空白，照分光光度法(中国药典2010年版一部附录V A)，在525nm波长处20分钟内测定吸收度，以葡萄糖醛酸μg数对应的吸收度，计算回归方程。
[0024]1.2.3测定法
[0025]精密称取供试品3350mg，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密吸取供试品溶液0.2ml，加水补充体积至0.4ml，照标准曲线制备项下自“在冰水浴加入”起，依法操作测定吸收度，由回归方程计算酸性糖含量。
[0026]1.2.4糖醛酸含量测定结果
[0027]表1标准糖醛酸溶液吸收值
[0028][0029]根据以上数据，以糖醛酸含量为横坐标，吸收值为纵坐标，求得回归方程为Y＝0.0309X+0.0315，R＝0.9985。
[0030]根据实验结果，注射用银耳孢糖含酸性糖以葡萄糖醛酸计，不低于10％。
[0031]1.3蛋白的测定
[0032]取注射用银耳孢糖100mg，加水50ml溶解，取1ml，以中国药典2000版一部附录IX S测定，符合规定。
[0033]2、注本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种注射用银耳孢糖，其特征在于，单糖组成及摩尔比为甘露糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：木糖：岩藻糖＝66.2：10.75：1.12：19.20：2.82；其分子量分布范围为2000-50000Da，重均分子量为5900Da。2.根据权利要求1所述注射用银耳孢糖，其特征在于，含多糖以甘露糖计，不低于75％；含酸性糖以葡萄糖醛酸计，不低于10％。3.权利要求1所述注射用银耳孢糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a、取银耳孢糖，加纯净水，40℃条件下搅拌8小时后，离心，收集离心液，通过颗粒活性碳柱,收集洗脱液，浓缩至每ml含0.3g银耳孢糖，放置至室温，搅拌条件下，缓缓加入1.6倍量95％乙醇，继续搅拌20分钟，离心，收集离心液，搅拌条件下继续加入10倍量95％乙醇，继续搅拌20分钟，离心，收集沉淀，自然干燥，得粗多糖；b、取粗多糖粉末，加入20倍量盐酸水溶液，在90℃水浴中...

【专利技术属性】
技术研发人员：高阳，杨宪玲，高其品，赫玉芳，南敏伦，
申请(专利权)人：高其品，
类型：发明
国别省市：