一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猫杯状病毒VP1

【技术实现步骤摘要】
一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猫杯状病毒(Feline Calicivirus，Fcv)是猫科动物的常见病原，可通过口、鼻等途径感染，主要在口腔和呼吸道组织中增殖，FCV的单独感染或与其他病原的混合感染可引起猫的上呼吸道和口腔病变，临床见打喷嚏、眼鼻部出血、结膜炎、口炎、牙龈炎、口腔溃疡，严重者还会发生肺炎、跛行、流产、慢性胃肠炎、皮肤水肿及溃疡等。猫杯状病毒感染是猫的多发病，发病率高，死亡率低。FCV与猫疱疹病毒等感染引起的症状非常相似，也可引起很多复杂的非典型症状，单从临床症状难以确诊病原，还需结合实验室诊断确诊。目前针对FCV的实验室诊断包括病毒分离、核酸检测和血清学检测。
[0003]利用病毒分离的检测方法会变得困难。虽然病毒分离是最为可靠的检测方法，但其耗时长。而免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。胶体金标记免疫分析法是近年兴起并快速发展的一种新型分析技术，其特点是快捷简便、成本低、无污染，且操作简单，无需操作人员具备专业知识，与传统方法相比更为适合现场检测。与ELISA相比，具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。
[0004]通常大多数猫在感染猫疱疹病毒三周时体内抗体水平最高，随后机体内抗体水平快速下降，因此，利用血清学试验检测FCV感染急性期和康复之后的双份血清的中和抗体效价，具有回顾性诊断意义。
[0005]然而，目前针对血清学试验检测FCV感染的检测方法和工具仍具有较大局限性。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术第一方面提供一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
[0008]VP1和VP2来源于FCV病毒的FCV结构蛋白，即衣壳蛋白。其包括ORF2(Open Reading Frame，ORF，开放阅读框)编码的VP1和ORF3编码的VP2，VP2分为A～F 6个区域，A区位于氨基末端1-120aa，B区位于121～396aa，C区位于397～401aa，D区位于402～425aa，为高度保守区，E区位于426～520aa，F区位于521～668aa，位于衣壳蛋白高度保守的羧基端，该区位于病毒的表面。
[0009]在本专利技术的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。
[0010]本专利技术的第二方面提供一种编码本专利技术第一方面所述重组蛋白的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
[0011]该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。
[0012]本专利技术的第三方面提供一种表达载体，其包括本专利技术第二方面所述的基因。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，所述表达载体为pET30a，其具有卡那霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸(His)标签。
[0014]本专利技术的第四方面提供一种宿主细胞，其含有本专利技术第三方面所述的表达载体。
[0015]进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
[0016]在本专利技术的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。
[0017]本专利技术的第五方面提供一种制备本专利技术第一方面所述重组蛋白的方法，包括诱导本专利技术第四方面所述宿主细胞进行蛋白表达的步骤。
[0018]进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
[0019]在本专利技术的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、成本低、表达量大等优点。
[0020]在本专利技术的一些具体实施方案中，诱导大肠杆菌进行蛋白表达的步骤为：
[0021]S1，用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃培养所述大肠杆菌，
[0022]S2，当大肠杆菌培养液OD600至0.5-0.7时，用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h；
[0023]S3，将培养液于4℃，7000rpm离心10min，收集菌体；
[0024]S4，用缓冲液Binding Buffer破碎菌体；
[0025]S5，超声破碎菌体，条件为：500w，超声2s，间隔5s，共80-120次；
[0026]S6，4℃，12000rpm离心30min收集上清，所述重组蛋白在上清中。
[0027]优选地，步骤S2中在大肠杆菌培养液OD600至0.6时进行诱导。
[0028]优选地，步骤S5中，超声破碎100次。采用本专利技术的破碎方法，避免了破碎过于剧烈，造成重组蛋白损失的情况。
[0029]在本专利技术的一些实施方案中，进一步包括对重组蛋白进行纯化的步骤。重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。在本专利技术的一些实施方案中，选择亲和层析的方法，由于重组蛋白中加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度。
[0030]在本专利技术的一些具体实施方案中，将包含重组蛋白的上清过Ni柱，然后用洗脱缓冲液Elution Buffer洗脱得到目的蛋白。
[0031]优选地，所述洗脱缓冲液Elution Buffer的配方为：50mM Tris，0.2M Nacl，0.5M Imidazole，pH8.0。
[0032]本专利技术的第六方面提供本专利技术第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测猫杯状病毒抗体的试剂盒中的应用。
[0033]本专利技术的第七方面提供一种用于检测猫杯状病毒抗体的试剂盒，包括本专利技术第一方面所述的重组蛋白。
[0034]进一步地，所述试剂盒还包括鼠IgG和羊抗鼠IgG。
[0035]在本专利技术的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测猫杯状病毒抗体。
[0036]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：
[0037]S1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；
[0038]S2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；
[0039]S3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；
[0040]S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫杯状病毒VP1-VP2重组蛋白，其特征在于，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。3.一种编码权利要求1或2所述重组蛋白的基因，其特征在于，包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。4.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求3所述基因。5.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求4所述表达载体。6.一种制备权利要求1或2所述重组蛋白的方法，其特征在于，包括诱导权利要求3所述宿主细胞进行蛋白表达的步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pET30a，所述宿主细胞为大肠杆菌。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，诱导宿主细胞进行蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓光，
申请(专利权)人：杭州亿米诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：