一株生产辅酶I的酿酒酵母制造技术

本发明专利技术通过诱变得到了一种生产辅酶I的酿酒酵母，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20814。本发明专利技术的酿酒酵母生产辅酶I的能力比原始菌株提高了4倍多，具有开发应用价值。具有开发应用价值。

【技术实现步骤摘要】
the Surface Hydrophobicity of the NrdE(Ts)Protein.Appl.Environ.Microbiol.2005,71(9),5582-5586.)、芽孢杆菌等进行全细胞转化烟酰胺和腺嘌呤等物质生产NAD+，但产量低，导致生产成本高
[0006]采用生物酶法或者全细胞转化法来生产辅酶I都需要单独培养出微生物来制备酶或者用作催化剂来催化底物化合物发生酶促反应。显然，如果能够通过微生物一步发酵就直接产生NAD+将会是个完美的方案。

技术实现思路

[0007]为了寻找开发具有工业应用前景的辅酶I生产菌，我们对能够产生NAD+的现有技术微生物进行了广泛筛选，发现它们的发酵后的NAD+产量普遍太低，必须对这些微生物进行基因工程改造或者进行诱变育种来大幅度提高菌株的NAD+生产能力，才有可能进行工业化应用开发。我们在这两个研究方向上都已经取得了一定进展，例如通过对酿酒酵母进行诱变得到了一株生长旺盛、NAD+生产能力显著提高的突变菌株。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。
[0008]一株生产辅酶I的酿酒酵母，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20814。
[0009]根据本专利技术的第二个方面，提供了上述酿酒酵母在生产辅酶I中的应用。
[0010]优选地，通过上述酿酒酵母的发酵来生产辅酶I。
[0011]其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于酿酒酵母生长发酵的培养基。优选地，发酵培养基组成如下：葡萄糖50g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物15g/L、NaCl 5g/L、KH2PO
4 1g/L、K2HPO
4 1g/L、MgSO4·
7H2O 0.3g/L，pH 5.4。
[0012]优选地，上述发酵温度为30
±
3℃比如30
±
2℃或30
±
1℃。
[0013]在一种实施方式中，发酵培养基中还可以添加有肌苷和烟酰胺作为底物。
[0014]本专利技术的酿酒酵母CGMCC No.20814通过发酵能够实现发酵液中辅酶I的有效积累，比原始菌株的辅酶I产量提高了至少4倍，具有工业化应用前景。
[0015]本专利技术诱变筛选出的酿酒酵母突变体的拉丁学名是Saccharomyces cerevisiae，中文名称是酿酒酵母，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期是2020年09月24日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20814。
[0016]突变菌株CGMCC No.20814的形态学及生理化学特性为：菌落颜色：乳白色；生长温度：30℃；最适pH：5.0-6.0；菌落形态：表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，质地均匀；生殖方式：出芽生殖，参见图1。
附图说明
[0017]图1为出发菌株SC001和诱变菌株SC0472培养48小时的平板培养状态照片。
具体实施方式
[0018]我们从众多的微生物中筛选出一株胞内产NAD+的安琪低糖型酿酒酵母菌，编号SC001(中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心提供)。但其表达辅酶I的能
力太低，要想进行工业化应用开发，必须进行菌种改良，大幅度提高辅酶I的表达水平。我们分别通过基因工程和诱变育种对该酵母菌进行了基因组改造和突变体筛选。
[0019]诱变育种是微生物改良常用的和有效的手段，人工诱变改良菌种的方法至今仍不失为选育高产菌的有效手段，目前使用的诱变剂基本上可分为物理诱变因子(如紫外线、X射线、快中子、常压室温等离子体(ARTP)等)、化学诱变剂(如氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍等)、生物诱变因子(如噬菌体)以及复合诱变四大类，它们都能够提高生物体突变频率，同时又造成生物体的大量死亡。专利技术人采用紫外线诱变形式对出发菌SC001进行多轮诱变处理，得到了一株辅酶I产量明显提高、生长旺盛(增殖速度比原始菌株SC001更快)、且遗传性状稳定的变异菌株，命名为SC0472。该突变菌株具有工业化开发的潜力，并可作为基因工程改造的对象。故将其提交菌种保藏，保藏编号为CGMCC No.20814。
[0020]在本文中，术语“辅酶I”和“NAD+”表示相同的意义，可以互换使用，这是本
公知的。类似地，术语“紫外”或“紫外线”和“UV”表示相同的意义，可以互换使用。
[0021]以下结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。
[0022]实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
[0023]实施例
[0024]材料和方法
[0025]产NAD+酿酒酵母菌(编号SC001)，由中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心惠赠。
[0026]YPD固体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 5.8-6.0；
[0027]YPD液体种子培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH 5.8-6.0；
[0028]发酵培养基：葡萄糖50g/L、蛋白胨15g/L、酵母提取物15g/L、NaCl 5g/L、KH2PO
4 1g/L、K2HPO
4 1g/L、MgSO4·
7H2O 0.3g/L，pH 5.4。
[0029]紫外诱变仪：北京赛百奥科技有限公司，CB10-UV8A型。
[0030]实施例1：紫外线诱变和筛选
[0031]酵母细胞悬浮液制备：
[0032]取1环酿酒酵母菌SC001活化菌株，接种于盛有YPD液体种子培养基试管中，30℃、200rpm培养24h，取5ml接种到盛有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，30℃、200rpm培养12h使细胞处于对数生长中期。用无菌水稀释，制成浓度为106CFU/mL的菌悬液。
[0033]紫外诱变：
[0034]开启紫外灯预热30min，取4ml酵母细胞悬浮液于直径9cm培养皿中，液体厚度为2mm左右，将培养皿于灯管30cm处分别照射1、2、3、4min，取出。诱变后的诱变液和未诱变的菌液进行10倍稀释法稀释涂平板，平行样3个，在30℃生化培养箱中培养2d后计数观察结果，计算致死率。
[0035]致死率(％)＝(对照菌落数-处理菌落数)/对照菌落数X100％。
[0036]选取85％致死率的诱变计量(2min)为试验的诱变照射时间，处于对数生长期的酿酒酵母SC001经UV照射诱变后，涂布于YPD固体培养基后，在30℃生化培养箱里培养2d，使平
板上生长出单菌落，获得紫外诱变突变体库。
[0037]实施例2：突变菌株高通量筛选
[0038]将紫外诱变突变体库中的单菌落用牙签接种到含2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株生产辅酶I的酿酒酵母，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20814。2.如权利要求1所述酿酒酵母用于生产辅酶I的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如权利要求1所述酿酒酵母的发酵来生产辅酶I。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成如下：葡萄糖50g/L、蛋白胨15g/L、酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶荣盛，朱傅赟，郑云，沈正权，原犇犇，孙梁栋，潘震华，沈青，胡海亮，刘萍，
申请(专利权)人：湖州颐盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：