一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种增强产甘油假丝酵母2

【技术实现步骤摘要】
一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量的方法


[0001]本专利技术涉及一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性及产量的方法，属于基因工程


技术介绍

[0002]2-苯乙醇(2-PE)是一种高级醇，具有玫瑰花香，可普遍应用于烟草、食品、化妆品等行业中。近年来，2-苯乙醇市场需求不断增加。现有的2-苯乙醇的生产方法主要为化学合成法、植物萃取法和生物法，化学合成法制备的2-苯乙醇因其含有致癌物质(苯乙烯等)已被禁止在化妆品、食品等领域使用，而植物萃取法获得的天然2-苯乙醇，其原材料(玫瑰花等)供应价格昂贵且产量无法满足市场供应；因此生物法制备2-苯乙醇具有广阔的应用前景。而生物法中，通常是通过酵母生物转化生产2-苯乙醇，其具有很大的潜在价值；但是高浓度的2-苯乙醇对酵母自身有很大的毒性，可抑制酵母的生长，从而降低了2-苯乙醇的产量。
[0003]基于发酵法生产天然2-苯乙醇具有广阔的应用前景，因此，对于耐2-苯乙醇的酵母菌株的研究开发成为一项具有很大工业应用价值的研究。
[0004]为解决这一瓶颈，研究者多采用以下解决方案：1、采用原位萃取技术，降低发酵液中2-苯乙醇浓度进而减弱产物对细胞生理代谢的抑制功能，提高产物的合成速率。然而由于萃取剂的加入，增加了下游产物分离的难度及成本，另外萃取剂难以清除干净严重影响了产品的质量。2、诱变获得高耐受菌株，但此方法效率低，周期长。
[0005]因此，采用上述方法均无法实现高效高产2-苯乙醇，专利技术人课题组前期通过利用基因工程的手段，在产甘油假丝酵母中过表达erg4基因，以提高产甘油假丝酵母对2-苯乙醇耐受性；但该基因的过表达并未显著提高2-苯乙醇的产量，可能原因在于erg4基因过表达后，细胞膜中麦角固醇含量提高导致细胞膜强度增加，不利于2-苯乙醇的外排，因此，如何进一步提高产甘油假丝酵母对2-苯乙醇耐受性及进一步提高2-苯乙醇的产量具有重大研究意义。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术中的缺点，本专利技术在产甘油假丝酵母中过表达了1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)，1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶SLC1催化3-磷酸甘油合成磷脂酸，是磷脂合成途径的关键酶。而磷脂是细胞膜的重要组成成分。菌株可通过调整磷脂分子的种类(PA，PE和PG等)、结构(脂肪酸碳链的长度和饱和度等)和丰度抵御外界环境损伤。因此，本专利技术通过基因工程改变SLC1基因的表达量，进而调整磷脂分子组成抵御外界损伤，以期进一步提高产甘油假丝酵母对2-苯乙醇的耐受性及2-苯乙醇的产量。
[0007]产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018(已在公开号为CN105713933B的专利中公开)是一株具有优良发酵性能的工业菌株，具有高效的2-苯乙醇
合成能力，及较完整的基因改造工具，为进一步分子改造菌株提高2-苯乙醇的耐受性及产量提供了有利的基础。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种产甘油假丝酵母工程菌，是以pGAPa为载体(记载于公开号为CN 110079468 A的申请文本中)，过表达1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M93018为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶来源于产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种构建上述产甘油假丝酵母工程菌的方法，包括以下步骤：
[0013](1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，PCR扩增编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的SLC1基因；
[0014](2)将SLC1基因插入到质粒pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达SLC1基因的重组质粒pGAPa-SLC1；
[0015](3)将重组质粒pGAPa-SLC1转化至产甘油假丝酵母中。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述转化是通过醋酸锂转化法进行的。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，PCR扩增的上游引物SLC1 F核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物SLC1 R核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
[0019](1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物SLC1 F(SEQ ID No.2)和SLC1R(SEQ ID No.3)PCR扩增SLC1基因；
[0020](2)利用一步克隆法将其插入到质粒pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达重组质粒pGAPa-SLC1；
[0021](3)经限制性内切酶Sac I线性化后，通过醋酸锂(LiAC)转化法将其转入产甘油假丝酵母CCTCC M 93018中，线性化的重组质粒pGAPa-SLC1通过同源重组整合到产甘油假丝酵母的5.8S序列，经MM平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，获得过表达SLC1基因的产甘油假丝酵母重组菌株CgSLC1。
[0022]本专利技术的第三个目的是提供一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法，是以pGAPa为载体，在产甘油假丝酵母中过表达了1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0023]本专利技术的第四个目的是提供一种生产苯乙醇的方法，所述方法为将上述产甘油假丝酵母工程菌接种至含有L-苯丙氨酸的反应体系中进行反应。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将挑取上述工程菌接入种子培养基中，在28-30℃，200-220rpm条件下，振荡培养12-20h，得到液态种子；将得到的液态种子按1-5％(v/v)的接种量接入含有L-苯丙氨酸的发酵培养基中，控制发酵温度为28-30℃，转速为
200-220rpm，发酵时间为40-60h。
[0025]本专利技术的第五个目的是提供上述产甘油假丝酵母工程菌在制备食品、化妆品或香精中的应用。
[0026]有益效果
[0027]本专利技术通过构建过表达编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的SLC1基因的产甘油假丝酵母工程菌，提高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产甘油假丝酵母工程菌，其特征在于，是以pGAPa为载体，在产甘油假丝酵母中过表达了1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.如权利要求1所述的产甘油假丝酵母工程菌，其特征在于，以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为宿主。3.如权利要求1或2所述的产甘油假丝酵母工程菌，其特征在于，编码所述1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种构建权利要求1-3任一所述的产甘油假丝酵母工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，PCR扩增编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶的SLC1基因；(2)将SLC1基因插入到质粒pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达SLC1基因的重组质粒pGAPa-SLC1；(3)将重组质粒pGAPa-SLC1转化至产甘油假丝酵母中。5.如权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，刘芳，王玉芹，陆信曜，宗红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：