一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了生物技术领域的S1：心肌肥大相关候选miRNA的建立，从文献中筛选出影响心肌肥厚形成的关键miRNA，对候选的关键miRNA采取polyA尾法进行设计引物，并对设计引物进行后续鉴定；S2：待选靶标microRNA小样本筛选，对小样本使用试剂盒进行microRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上进行Real Time PCR反应液的配制，然后进行定量PCR反应；S3：待选靶标microRNA大样本验证，本方法所述心肌肥大相关microRNA鉴定方法效率高；本方法采用多条microRNA进行心肌肥大鉴定筛选，更为准确。更为准确。更为准确。

【技术实现步骤摘要】
一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]心肌肥厚是一个受多因素影响的心脏疾病，是公认的导致心肌猝死、心力衰竭的重要原因之一。自从Jarcho等首次报道了心脏肌球蛋白重链基因MYH6错义突变可导致心肌肥厚后，大量研究相继发现了与心肌肥厚相关的13个致病基因和900多个突变位点。遗传学证据表明编码控制肌小节收缩的肌丝蛋白的显性突变能够诱导心肌肥厚的产生。截至目前，70％的心肌肥厚患者携带有MYH7突变或肌蛋白结合蛋白MYBPC3；约5％的心肌肥厚患者携带肌钙蛋白TNNT2和另外几个致病基因突变。另外还有很多基因被证实与心肌肥厚发生有关但是缺少足够的病理学证据，包括肌联蛋白TTN、视松蛋白TCAP、黏着斑蛋白VCL、膜连接蛋白JPH2等。截止到当前，OMIM共收录了27种与心肌肥厚相关的基因。然而经过近20年的临床验证，人们发现通过检测心肌肥厚相关基因突变做临床诊断结果是不可靠的，主要原因是因为心肌肥厚患者展现出来的表型与基因型均具有明显的异质性。这就导致使用某种基因突变信息来判定心肌肥厚预后的概念当前是无法实现的。
[0003]MicroRNA(miRNA)是一类进化保守、大小约为21个核苷酸的小分子非编码RNA，普遍存在于真核生物中。一般通过非完全碱基互补配对方式识别靶基因mRNA的3
’
非翻译区(3
’
UTR)的序列元件，在转录后水平负调控靶基因的表达。miRNA作为一类最为庞大的基因表达调控因子，对个体的生长发育至关重要，同时与癌症、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等人类重大疾病发生发展密切相关[22-24]。大量的基因芯片分析miRNA表达图谱后发现了许多与心肌肥厚和心力衰竭中相关的miRNA，阻碍心肌肥厚形成的关键miRNA主要包括miR-1和miR-133；其中miR-1通过抑制其下游靶基因细胞骨架调控蛋白Twf1和胰岛素生长因子发挥作用；miR-133则通过抑制其下游基因Rho激酶家族RhoA和Cdc2、及RNA聚合酶II的负调控因子NelfA起作用。促进心肌肥厚形成的关键miRNA主要包括miR-195、miR-208、miR-499、miR-23、miR-100、miR-18b等；其中miR-208、miR-23、miR-100、miR-133分别通过影响各自的靶基因Myh6\Myh7、钙依赖磷酸酶NFAT、缺氧诱导因子HIF-1α和长寿因子Sirt1、肌肉泛素蛋白MuRF等调控心肌肥厚过程；miR-195、miR-499和miR-18b的靶基因尚不清楚。
[0004]目前研究者积累了大量的心肌肥厚实验证据，但是无论是致病基因突变水平还是转录调控方面均未能完全阐明其发病机理和调控方式。仅有70％的肥厚型心肌病患者中发现了关联基因突变，然而反过来这些基因突变并不能作为临床诊断的依据，因此这些基因突变应该被看作为心肌肥厚致病基因而非关键诊断标记物。
[0005]有研究表明，心肌梗死等心肌病变引起的原发性心肌肥厚患者血清中miR-208、miR-499、miR-23、miR-100、miR-18b等microRNA的水平显著升高，而无心肌梗死患者血清中该microRNA并未出现显著升高。我们检测的样品均来自继发性心肌肥厚患者(与已研究的原发性心肌肥厚类型不同)，患者由于心血管病变导致血流自心室流出的阻力(即压力负
荷)增加，或流入心室的血量(即容量负荷)增加，或心排出血量下降所致代偿性肥大，产生心腔扩张(左心室房增大)和心壁(室间隔增厚)肥厚。因此，本专利研究继发性心肌肥厚患者血清中microRNA该生物标记的表达情况，对进一步探究心肌肥厚发生发展机制和转录组、表观遗传水平的调控奠定基础。
[0006]心肌肥厚的在转录水平上及表观遗传水平上的调控机制仍缺少足够的分子生物学及临床证据；另外相比于基因组学及分子生物学在肿瘤领域的广泛应用，心肌肥厚的研究和临床转化相对比较滞后。本研究寻找能够准确诊断心肌肥厚的生物标记物，对进一步探究心肌肥厚发生发展机制和转录组、表观遗传水平的调控奠定基础。
[0007]基于此，本专利技术设计了一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒，以解决上述提到的问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒，以解决上述提到的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法和试剂盒，包括以下步骤：
[0010]S1：心肌肥大相关候选miRNA的建立，
[0011]从文献中筛选出影响心肌肥厚形成的关键miRNA，对候选的关键miRNA采取polyA尾法进行设计引物，并对设计引物进行后续鉴定；
[0012]S2：待选靶标microRNA小样本筛选，
[0013]对小样本使用试剂盒进行microRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上进行Real Time PCR反应液的配制，然后进行定量PCR反应；
[0014]S3：待选靶标microRNA大样本验证，
[0015]对在小样本中定量PCR鉴定到的hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，miR-20a，miR-212，miR-208a 7条microRNA进行了大样本验证；室温融化cDNA模板、上游引物、2
×
miRcute Plus miRNA Premix、50
×
ROX Reference Dye和Reverse Primer，之后置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制；将配制的Real Time PCR反应液混合物分装至每个检测孔中，按混合物cDNA-ddH2O的顺序加样，配制体系，彻底混匀。
[0016]优选的，所述关键miRNA包括hsa-miR-200a-5p，hsa-miR-208a，hsa-miR-221，hsa-miR-20a，hsa-miR-212，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-195-5p，hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，hsa-miR-29a-3p，hsa-miR-30a-5p，hsa-miR-150-5p。
[0017]优选的，所述关键miRNA通过影响各自的靶基因Myh6\Myh7、钙依赖磷酸酶NFAT、缺氧诱导因子HIF-1α和长寿因子Sirt1、肌肉泛素蛋白MuRF因子调控心肌肥厚过程。
[0018]优选的，所述Real Time PCR反应液的配制有如下组成成分：2
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miRcute Plus miRNAPremix、Forward Pri本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：心肌肥大相关候选miRNA的建立，从文献中筛选出影响心肌肥厚形成的关键miRNA，对候选的关键miRNA采取polyA尾法进行设计引物，并对设计引物进行后续鉴定；S2：待选靶标microRNA小样本筛选，对小样本使用试剂盒进行microRNA的定量检测反应，使用荧光定量仪器，在冰上进行RealTime PCR反应液的配制，然后进行定量PCR反应；S3：待选靶标microRNA大样本验证，对在小样本中定量PCR鉴定到的hsa-miR-214-3p，hsa-miR-23b-5p，hsa-miR-133a-5p，hsa-miR-1-3p，miR-20a，miR-212，miR-208a 7条microRNA进行了大样本验证；室温融化cDNA模板、上游引物、2
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miRcute Plus miRNA Premix、50
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ROX Reference Dye和Reverse Primer，之后置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制；将配制的Real Time PCR反应液混合物分装至每个检测孔中，按混合物cDNA-ddH2O的顺序加样，配制体系，彻底混匀。2.根据权利要求1所述的一种心肌肥大疾病相关生物标记的检测方法，其特征在于：所述关键miRNA包括hsa-miR-200a-5p，hsa-miR-208a，hsa-miR-221，hsa-miR-20a，hsa-miR-212，hsa-miR-92b-3p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-195-5p...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯琳琳，韩宗强，陈厦，刘春秀，王桂立，
申请(专利权)人：北京小汤山医院，
类型：发明
国别省市：