一种肿瘤组织消化液及其方法技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤组织消化液及其方法，消化液包括有以下成份：II型胶原酶2mg/ml；IV型胶原酶2mg/ml；Dispase(中性蛋白酶)0.2ml/ml；DNA酶12units/ml；FBS体积分数10％；DMEM 0.8ml/ml；CaCl

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤组织消化液及其方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，具体涉及一种肿瘤组织消化液及其方法。

技术介绍

[0002]随着生物医学的发展，为了解决基因高通量测序技术在肿瘤学研究过程中掩盖了细胞之间的异质性的问题，由于单细胞转录组测序技术能在单细胞水平上揭示肿瘤组织中不同细胞的特性和相互联系，为了研究单个肿瘤细胞的生物学特性，肿瘤细胞的单细胞转录组测序技术已经在肿瘤学方面成为临床专家和科研工作人员关注的焦点。
[0003]单细胞悬浮液在肿瘤病理、肿瘤分子生物学研究方向有着广泛的用途，目前常用的新鲜肿瘤的组织单细胞悬液的制备方法主要为：先利用机械和酶处理进行组织解离，之后利用酶促消化用于分离。不同肿瘤组织消化目前使用的酶方案可能不同，对于较敏感的细胞类型在不同的细胞消化过程中可能会被破坏，部分肿瘤组织手术后组织含量不高，导致消化后细胞悬液消化不足，影响后续实验进行。
[0004]目前在肿瘤消化过程中，存在的问题主要有：组织消化不彻底、消化时间长、酶浓度过高等导致细胞死亡，导致后续的实验出现一系列问题。
[0005]目前肿瘤细胞分离方法将为常见的是通过II型胶原酶消化法来进行获取，但是该方法存在较多的缺点，主要包括：1、II型胶原酶虽然属于温和的消化酶，但是依然对细胞有损伤，特别是在消化过度时，对细胞的损伤十分明显。2、II型胶原酶在使用过程中极易出现活性丧失，降低消化作用，严重的将导致无法实现对肿瘤细胞的消化分离。3、使用II型胶原酶消化后肿瘤细胞容易消化不完全，消化时间过长，这将会导致后续单细胞测序的实验进行较为严重的影响。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种肿瘤组织消化液及其方法，在肿瘤组织消化中细胞获取率高且细胞具有较高的活性，细胞得率高，对细胞损伤较小，转录组变化低，可以后续进行培养或者单细胞转录组测序。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种肿瘤组织消化液，包括有以下成份：
[0009]II型胶原酶
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2mg/ml；
[0010]IV型胶原酶
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2mg/ml；
[0011]Dispase
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0.2ml/ml；
[0012]DNA酶
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12units/ml；
[0013]FBS
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体积分数10％；
[0014]DMEM
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0.8ml/ml；
[0015]CaCl2ꢀꢀ
3mmol/L。
[0016]本专利技术还提供一种利用上述肿瘤组织消化液制备肿瘤组织单细胞悬浮液的方法，
包括如下步骤：
[0017]S1：获得肿瘤组织；
[0018]S2：将肿瘤组织置于平皿中，用移液器向肿瘤组织滴加2-3滴权利要求1所述肿瘤组织消化液防止干燥；
[0019]S3：将肿瘤组织切碎，添加权利要求1所述肿瘤组织消化液进行消化；置于37℃摇床30-40min，每隔15min用移液器混匀；
[0020]S4：消化完全后，过滤2次，离心；
[0021]S5：向步骤S4中离心得到的沉淀加入DPBS重悬细胞团，充分吹散后300g离心；
[0022]S6：缓慢吸取上清并丢弃，充分混匀下层细胞沉淀，得到的细胞即为活性较高的肿瘤细胞单细胞悬液。
[0023]进一步地，步骤S4的具体过程为：先用70um滤网过滤，再用40um滤网进行2次过滤后离心，离心速度为400g，时间为4min。
[0024]本专利技术的有益效果在于：本专利技术所提供的肿瘤组织消化液增加了Dispase(中性蛋白酶)，该蛋白酶可以更好地对致密的肿瘤细胞之间蛋白连接进行消化解离，同时提高了Dispase酶含量，显著地提高了消化效率。此外，本专利技术所提供的肿瘤组织消化液新增了IV型胶原酶，可以显著地提高消化效率，减少消化时间，而且本专利技术的消化液中胶原酶IV和II的浓度较低，对细胞损伤较小，有助于提高细胞悬液中细胞活率。
附图说明
[0025]图1为采用本专利技术实施例2方法时的细胞活率图；
[0026]图2为采用常规消化方法时的细胞活率图。
具体实施方式
[0027]以下将结合附图对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。
[0028]实施例1
[0029]本实施例提供一种肿瘤组织消化液，含有以下成份：
[0030]II型胶原酶
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2mg/ml
[0031]IV型胶原酶
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2mg/ml
[0032]Dispase(中性蛋白酶)
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0.8ml/ml
[0033]DNA酶
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12units/ml
[0034]FBS
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体积分数10％
[0035]DMEM
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0.8ml/ml
[0036]CaCl
2 3mmol/L
[0037]实施例2
[0038]本实施例提供一种利用实施例1所述肿瘤组织消化液制备肿瘤组织单细胞悬浮液的方法，包括如下步骤：
[0039]S1：获得肿瘤组织；
[0040]S2：将步骤S1中获得的肿瘤组织置于平皿中，用移液器向肿瘤组织滴加2-3滴实施例1所述的肿瘤组织消化液防止干燥；
[0041]S3：将0.5-2g的肿瘤组织切碎，并向肿瘤组织添加到5ml实施例1所述的肿瘤组织消化液进行消化；置于37℃摇床30-40min，每隔15min用移液器混匀；
[0042]S4：消化完全后，过滤2次，离心。
[0043]S5：向步骤S4离心得到的沉淀加入5ml的DPBS重悬细胞团，充分吹散后300g离心。
[0044]S6：缓慢吸取3.5ml上清并丢弃，用常规口径枪头充分混匀下层细胞沉淀，得到的细胞即为活性较高的肿瘤细胞单细胞悬液。
[0045]在本实施例中，步骤S4的具体过程为：先用70um滤网过滤，再用40um滤网进行2次过滤后离心，离心速度为400g，时间为4min。
[0046]用常规消化方法消化的肿瘤细胞悬液和用实施例1方法消化的肿瘤细胞悬液结果对比如表1所示。
[0047]表1
[0048][0049]实施例2方法的细胞活率图如图1所示，常规消化方法的细胞活率图如图2所示。通过AO/PI染色，可以看出，实施例2方法中的活细胞(图1中呈白色、较大较亮的光点，原图呈绿色)远远多于死细胞(图1中较小较暗的光点，原图呈红色)，而常规消化方法中的死细胞则较多(图2中呈白色、较大较亮的光点为活细胞，原图呈绿色；较小较暗的光点为死细胞，原图呈红色)。
[0050]需要说明的是，所述常规消化方法的过程为：取肿瘤组织样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤组织消化液，其特征在于，包括有以下成份：II型胶原酶2mg/ml；IV型胶原酶2mg/ml；Dispase 0.2ml/ml；DNA酶12units/ml；FBS体积分数10％；DMEM 0.8ml/ml；CaCl
2 3mmol/L。2.一种利用权利要求1所述肿瘤组织消化液制备肿瘤组织单细胞悬浮液的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：获得肿瘤组织；S2：将肿瘤组织置于平皿中，用移液器向肿瘤组织滴加2-3滴权利要求1所述肿瘤组织消化液防止干燥；S3：将肿瘤组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：林传勇，吴声鹏，
申请(专利权)人：广州元信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：